玉米MCM2基因的克隆与功能验证

李欢欢，武文昊，田文静，郭东伟

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨陵 712100)

植物的生长发育受严格的细胞周期调控。为了满足特定组织或细胞类型的生长发育和代谢要求，细胞的有丝分裂方式往往会发生一些改变，如核内有丝分裂、内复制。核内有丝分裂是指有丝分裂过程中核膜不消失，有丝分裂发生在细胞核内部，最终产生巨大的染色体如血液中的巨噬细胞。内复制也叫内多倍化，是指细胞只进行DNA复制，却不发生分裂的一类特殊的细胞周期形式，由S期和G期组成，没有染色体的浓缩和纺锤丝的形成，经过几轮复制后，会产生多倍化的细胞核，且相同组织的相邻细胞之间由于内复制发生程度的不同而呈现不同的倍性[1-2]。内复制普遍存在于植物中，据统计超过90%的被子植物特定的器官中都存在不同程度的内复制现象，尤其在禾谷类作物种子的胚乳、十字花科植物的块根、百合科植物的鳞茎、葫芦科植物的胎座组织等一些快速生长的组织中，往往存在大量的内复制细胞[3]。目前，大量的研究认为，内复制与植物的许多生命活动息息相关[4]，如胚轴伸长、毛状体生长等[5-7]。在禾谷类植物种子的胚乳中，细胞在授粉后第6-8天开始进行内复制，第18-20天达到高峰，30天以后随着细胞凋亡的发生，淀粉的积累，内复制也逐渐停止，其过程与籽粒的灌浆和快速膨大期完全一致，因此，内复制也被认为是籽粒发育的关键性动力；此外，也有研究证实植物可以通过提高内复制程度来抵御环境胁迫[8-10]。由此可见，细胞周期的调控对植物生长发育至关重要。

由于内复制是一种缺少了分裂期的特殊有丝分裂，因此，大多数研究认为，有丝分裂和内复制共用了相同的调控网络，其中CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)的活性是调控内复制发生的关键，CDK活性高，细胞维持有丝分裂，活性下降细胞则由有丝分裂转向内复制，而且这一调控机制相当保守[11]。此外，内复制的启动也与pre-RC(复制前复合物)的精确组装密切相关，pre-RC被认为是DNA进行复制许可和DNA解旋的关键；而pre-RC的精确组装又受到MCM(微染色体维持蛋白)的影响。已有研究证明MCM2-7与G1期的DNA复制起源特异性相关[12]，在G1期，MCM2-7(微染色体维持蛋白)与Cdc6和Cdt1稳定结合形成pre-RC，然后CDK和DDK(dbv4依赖激酶)激活MCM蛋白及其解旋酶活性，促使pre-RC启动DNA复制[13]。在植物中，拟南芥的MCM7参与了早期胚胎发育和种子发育期间的胞质分裂过程[14-16]；玉米的MCM3和MCM6在增殖组织中高度表达[17-18]。报道还发现，细胞中MCM水平的降低可能会打破基因组稳定[19-20]。因此，MCM基因也是调控植物内复制发生的关键因子。

本课题组前期用关联分析方法，从119个不同内复制水平的自交系中关联到4个内复制相关基因，其中一个为MCM基因。为了深入了解其在内复制调控中的作用机理，本研究通过数据库对MCM家族进行检索、比对及筛选，分析了玉米MCM基因的基本生物信息特征，又对非生物胁迫条件下的表达特征进行了系统分析，并通过转基因和酵母双杂方法对其中ZmMCM2的功能和分子互作情况进行了初步探索，以期能够为进一步深入理解MCM基因在内复制调控过程中的作用机理提供实验证据。

1 材料和方法

1.1 实验材料及处理

玉米(ZeamaysL.)自交系B73由西北农林科技大学农学院玉米生物学与遗传改良重点实验室提供。选取饱满且未受损的B73种子置于小烧杯中，加入钾肥溶液，浸泡72 h，使其充分吸涨。然后将种子铺于湿润的棉纱，置于28 ℃条件下培养。将萌发的种子播于营养土，待幼苗长至三叶一心时，挑选长势一致的玉米苗，将其根部洗净进行处理。

处理条件分别为：100 μmol/L ABA、20% PEG6000、200 mmol/L NaCl、42 ℃、4 ℃[21]。每个处理设置3个重复。在12、24、48和72 h分别取20% PEG600、200 mmol/L NaCl、42 ℃、4 ℃处理条件下的玉米叶片；在2、6、12和24 h时取100 μmol/L ABA条件下的玉米叶片；0 h取样为对照。将收集到的玉米叶片用锡纸独立包裹，置于液氮桶中速冻，然后放于-80 ℃超低温冰箱保存，以备qRT-PCR使用。

1.2 方 法

1.2.1MCM家族基因生物信息学分析在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)查找并下载MCM蛋白结构域的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER网站的玉米基因组初步鉴定基因家族，然后去除重复和冗余[22]。通过CDD数据库以及SMART检索并查阅含有MCM结构域的基因序列[23-24]，使用Tbtools将含有MCM结构域的序列名对应的基因序列提取出来。使用网站(http:/linux1.softberry.com/berry.phtml)预测每个MCM蛋白的亚细胞定位，在Gramene(http://www.gramene.org/)数据库查询基因的理化性质。运用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)进行染色体定位分析，然后利用MCScan进行基因复制的分析。使用MEGA7.0中的邻接法(neighbor- joining, NJ)绘制进化树，设置Bootstrap为1 000次。选取MCM家族基因的前1 500 bp，并将其上传到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站进行顺式作用元件的分析，然后使用GSDD2.0网站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)绘图。

1.2.2 不同胁迫处理下MCM家族基因的特异性表达利用诺唯赞的植物总RNA提取试剂盒和cDNA第一链反转录试剂盒进行RNA的提取和反转录。通过qRT-PCR分析MCM家族基因的表达情况，设置3个生物学重复，最后将数据转换成热图形式。qRT-PCR体系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye20.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。运用2-ΔΔCt的方法计算相对表达量[25]。

1.2.3ZmMCM2基因的克隆及转基因拟南芥植株的产生和表型分析用F(GATAAGCTTGAT-ATCGAATTCATGGATGACTCGGAGAACAA)和R(AGAACTA-GTGGATCCCCCGGGTTACT-CCGCCAGTGGAT-GCC)引物扩增基因ZmMCM2。以300 ng单链cDNA为模板，依次加入5×PrimeSTAR GXL 缓冲液10 μL，dNTPMIX 4 μL，PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶1 μL，混合体系共50 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.30 min，30次循环；最后在72 ℃延伸10 min。回收扩增产物，再凝胶纯化，然后将目的片段插入OE6HA载体中。将构建好的重组质粒转进农杆菌GV3101，并用蘸花法转化拟南芥。在含PPT的平板上选择转基因植株，然后转移到土壤中。经过3代鉴定和筛选，最终得到4个纯合株系。后续实验采用T3代纯合株系进行表型分析。

将4个过表达及野生型拟南芥种子放于无菌水，置于4 ℃春化3 d；然后在春化好的种子中加入75%乙醇1 mL，摇8 min；用95%乙醇冲洗3次；在洗好的种子中加入0.3 mL无水乙醇，用枪吸打在已灭菌的滤纸上；待种子晾干，将种子均匀地撒于MS培养基，置于4 ℃放2 d；然后放在人工气候箱中正常培养。待长出4片真叶，移植到营养土中正常培养。之后，对4个过表达拟南芥阳性植株(35S:ZmMCM2)和野生型(WT)在植株发育、种子大小、花期、莲座叶数方面进行对比研究。

1.2.4 植物流式细胞术分析将野生型和过表达ZmMCM2的拟南芥植株叶片用刀片切碎，分别置于细胞核裂解液中：10 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L KCl，5 mmol/L HEPES，3 mmol/L DTT，0.2%TritonX-100。然后利用50 μm孔径的过滤器进行过滤，用(2 μg/mL)DAPI在冰上染色30 min。以C-value作为评价内复制程度的指标，C-value的计算方法为[26]

式中，C-value代表细胞经历的循环值；n2C～n32C依次代表细胞核中2C～32C倍性细胞核粒子的数目，一个单倍体细胞核的DNA含量定义为1C。

1.2.5 原生质体的制备与转化玉米种子次氯酸钠消毒后，无菌水浸泡过夜，种于土壤中，25 ℃暗培养，5～10 d可用于提取原生质体，原生质体的提取方法参考文献[27]，略有改动。选取中部叶片分离原生质体，切成大约0.5 mm宽的条块，20～30个条块放在一起切碎，将其转移到酶解液(1.5% 纤维素酶，0.3% 果胶酶，0.6 mol/L甘露醇，10 mmol/L MES，混合液调节pH至5.7，再加入1 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，混匀)中，避光，真空泵-15～-20(inHg)抽30 min；再避光酶解5～6 h，同时缓慢摇动(圆周摇床，速度40 r/min)；酶解结束后，加入与酶解液等体积的W5混合液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，4 mmol/L MES，调节混合液pH至5.7)，稍有力地用手水平摇动10 s，释放原生质体；然后使用40 μm尼龙膜将原生质体过滤到50 mL的圆底离心管中，100 g水平离心3 min，待原生质体沉淀，吸出上清；在沉淀中加入15 mL W5溶液，使原生质体重悬，并冰浴30 min，使原生质体自然沉降，尽可能弃上清；随后，加入适量MMG混合液(0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L CaCl2，4 mol/L MES,调节混合液pH至5.7)重悬沉淀，调原生质体密度至2×106个/mL，运用血球计数器计数；最后，吸取20 μg质粒与200 μL原生质体拨打混匀，并加入220 μL新配的PEG混合液(40% PEG4000，0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/L CaCl2)，混匀，在室温下避光放置15～20 min，进行诱导转化；诱导转化结束后缓慢加入880 μL W5混合液，轻轻颠倒混匀，100 g水平离心3 min，弃上清；再加入1 mL W5混合液重悬沉淀，并转移到六孔板中(已预先加入1 mL W5混合液)22 ℃暗处培养12～18 h，用于激光共聚焦显微镜下观察鉴定。

1.2.6 酵母双杂通过同源重组的方法将目的序列与pGBKT7载体连接，运用醋酸锂(PEG/LiAc)方法将pGBKT7-ZmMCM2/pGADT7、pGBKT7-lam/pGADT7-T、pGBKT7-53/pGADT7-T共转到Y2H酵母菌株中，并将酵母共转液置于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板进行自激活验证[28]。将pGBKT7-ZmMCM2转入Y2H酵母菌株，置于SD/-Trp，并挑取大且圆润的阳性单克隆用于后续实验。

运用Mating筛库法筛选互作蛋白，流程如下：将pGBKT7-ZmMCM2菌液置于30 ℃恒温摇床，进行小摇活化，随后进行大摇；其间吸出3 mL测OD600值，最终达到的范围是0.8

测序结果进行序列比对，经查阅文献确定与研究内容相关的基因，对其进行回转验证。回转验证流程如下：将阳性克隆接种到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液体培养基中，30 ℃，200 r/min振荡培养3～4 d，待菌液浑浊，提取酵母细胞中的文库质粒。将提取到的文库质粒转入大肠杆菌TOP10，然后涂布于LB平板，37 ℃过夜培养。挑取单克隆于LB液体培养基中，进行扩大培养。提取大肠杆菌中的文库质粒。根据筛选基因在文库质粒中的插入位置，设计特异性引物来扩增文库片段，并对其进行回收、纯化。将文库片段和pGADT7重组。然后将阳性重组质粒和pGBKT7-ZmMCM2共转化Y2H酵母感受态，涂布于二缺、三缺以及四缺平板上，30 ℃倒置培养，待菌斑长出，每个菌斑滴上2 μL X-α-Gal，观察是否有菌落生长和变蓝，进而判定互作效应的真实性。

2 结果与分析

2.1 ZmMCM家族基因分析

通过筛选和鉴定，得到17条ZmMCM基因，将其分别命名为ZmMCM1～ZmMCM17(表1)。本研究发现开放阅读框大小为444(ZmMCM15)～2 874(ZmMCM2) bp，MCM基因含外显子为1(ZmMCM12)～19(ZmMCM6)个，17条基因预测定位均为细胞核。值得注意的是ZmMCM3和ZmMCM4，ZmMCM8、ZmMCM9、ZmMCM14、ZmMCM15和ZmMCM17，ZmMCM7和ZmMCM10，ZmMCM5和ZmMCM1，ZmMCM13和ZmMCM16，这13条基因在玉米中分布于不同的染色体，属于10种不同的蛋白，而在拟南芥中对应5种蛋白，表明了不同物种中MCM家族基因的扩张和进化是不同的，而且ZmMCM家族成员之间外显子数量差异可能与其功能多样性有关。

表1 玉米MCM家族基因鉴定Table 1 Identification of maize MCM family gene

2.2 ZmMCM基因染色体定位分析

图1显示，ZmMCM家族成员分布于6条染色体，其中3号、6号和8号染色体上分布的基因最多，都是4条基因，1号染色体分布的基因最少，只有1个基因。而且ZmMCM家族基因中存在2个串联重复序列，分布在6号染色体上，还存在6条片段复制序列，除了1号染色体，其他染色体均分布有片段复制序列。因此，ZmMCM家族基因组的进化可能是由串联复制和片段复制引起的。

2.3 不同物种MCM蛋白系统进化树构建

利用玉米(Zm)、水稻(Os)与拟南芥(At)的MCM蛋白序列构建系统进化树，结果可分为6个亚家族(图2)。玉米、水稻以及拟南芥MCM家族成员在6个亚家族中均有分布。水稻和拟南芥的同一种MCM蛋白与玉米的相应MCM蛋白分布于不同的亚家族。只有ZmMCM2、OsMCM2和AtMCM2三个成员分布于第Ⅳ亚家族，且ZmMCM2和OsMCM2分支较晚，进化更为保守。分支越早的亚组之间具有较远的亲缘关系和进化关系，而同一组的MCM成员之间具有较高的同源性。结果表明大多数水稻和拟南芥MCM蛋白的遗传进化关系更亲近，而玉米MCM蛋白成员之间亲缘关系更近，结构更保守。

2.4 ZmMCM家族基因顺式作用元件分析

为了解玉米MCM基因的表达调控机制，对其启动子序列进行顺式作用元件预测，共预测到331个顺式作用元件(图3)。除了ZmMCM1和ZmMCM8，其他基因都至少含有一种与激素响应有关的顺式作用元件。除此之外，ZmMCM基因启动子中还存在与胁迫响应相关的顺式作用元件，如响应干旱的MBS和低温的LTR。表明ZmMCM基因可能参与非生物胁迫响应。本研究还发现部分基因启动子含有参与胚乳表达的GCN4_motif、玉米蛋白代谢调节的O2-site、种子特异性调控的RY-element和叶片衰老调控的W box，表明ZmMCM可能参与调控玉米不同阶段的生长发育。

2.5 不同胁迫处理下玉米MCM家族基因的表达

基于ZmMCM家族基因在激素以及胁迫方面的调控作用，为挖掘调控非生物胁迫的基因，选择苗期玉米作为实验对象，对其进行不同胁迫处理，以检测它们的表达水平。结果(图4)表明，ZmMCM家族基因在高盐胁迫下整体被抑制表达；ZmMCM7在ABA处理24 h时轻微诱导，说明它可能对重度的ABA胁迫具有一定的调控作用；ZmMCM12、ZmMCM13、ZmMCM14、ZmMCM15、ZmMCM16、ZmMCM17等在干旱胁迫12 h时表达水平显著提高，推测这些基因具有调节轻度干旱的能力；ZmMCM3在高温胁迫24 h时诱导表达，ZmMCM2在48和72 h时表达量呈现上调趋势，它们可能在一定程度上调节高温胁迫；同时，ZmMCM4、ZmMCM5、ZmMCM13、ZmMCM14、ZmMCM17在低温处理12、24、48和72 h时被显著诱导，且高于对照；ZmMCM3、ZmMCM10在12和24 h时表达量显著提高，这些基因能够对低温快速做出响应，表明它们可能在防御低温胁迫方面发挥重要作用。综上所述，MCM基因的表达受到ABA、NaCl胁迫的抑制，它们对胁迫几乎无响应，而面对干旱、高温以及低温的影响，在不同时间段表现出不同程度的应答。

2.6 35S:ZmMCM2的过表达影响拟南芥生长发育

图5，A显示，同一时期的过表达拟南芥植株较野生型矮化。这可能是因为ZmMCM2基因过度表达会对拟南芥的内复制产生一定的抑制作用，从而导致转基因植株的尺寸发生变化。ZmMCM2基因在花发育过程中并不显著，推测其在花发育过程中可能没有明显的调节作用(图5，B)。转基因拟南芥莲座叶数明显减少(图5，C)，且种子体积减小(图5，D、E)，这可能是内复制程度的变化影响了细胞的分裂与分化导致的结果。转基因拟南芥植株的突出表型说明，ZmMCM2基因的异源过表达影响了拟南芥植株的生长和发育。

2.7 35S:ZmMCM2的过表达抑制拟南芥叶片的内复制程度

利用流式的方法对过表达拟南芥植株的内复制程度进行分析，来进一步验证诸多表型的产生与内复制的关系。结果表明，与野生型相比，过表达植株2C、4C以及8C倍性细胞占比较大，且过表达拟南芥中没有出现16C(图6，A、B)；过表达植株的C值低于野生型(图6，C)。总之，研究结果表明过表达拟南芥植株的倍性降低，内复制程度被减弱。说明ZmMCM2基因负向调控了内复制的发生。

2.8 玉米MCM2的亚细胞定位

细胞周期调控因子的功能需要对特定细胞区域进行定位，因此，通过研究ZmMCM2蛋白在细胞内的定位情况，可为理解其作用机制提供研究方向。通过PEG介导法将ZmMCM2和GFP融合载体转化到玉米原生质体中进行表达，在激光共聚焦显微镜下观察发现，ZmMCM2-GFP融合蛋白在细胞核内出现强烈的绿色荧光，表示ZmMCM2蛋白主要在植物细胞核中表达(图7)。

2.9 ZmMCM2互作蛋白筛选

为更好地了解ZmMCM2蛋白的分子调节机制，运用酵母双杂交筛选与其相互作用的潜在蛋白质。首先通过自激活验证可知(图8，A)，阳性对照、阴性对照以及目的基因均在二缺板正常生长，四缺板上仅有阳性对照生长，因此，可判定ZmMCM2无自激活能力；然后运用Mating法筛选与ZmMCM2互作的蛋白，一共筛选出22个阳性克隆；最后，选择了一个与细胞周期相关的细胞分裂蛋白CDC73进行回转验证，结果表明ZmMCM2与CDC73之间存在互作关系(图8，B)。

3 讨 论

内复制是一种特殊的细胞周期[29]，对动植物的细胞生长起着至关重要的作用。细胞周期准确、规律地运转需要pre-RC的控制，而MCM2-7作为复制前复合体的组成部分，对pre-RC调控功能的实现至关重要[13]。因此，研究MCM遗传进化以及功能对于丰富内复制调控的分子机理具有重要意义。

本研究在玉米中共鉴定到17个ZmMCM家族基因，比拟南芥以及水稻多，这可能与玉米及其祖先在进化过程中基因组的扩张有关。而且染色体定位分析中存在串联重复和片段复制序列，这可能是导致ZmMCM家族基因数目增加的主要原因。ZmMCM基因启动子序列中含有许多与植物激素、以及胁迫响应相关的顺式作用元件。前人研究豌豆中MCM6基因的盐胁迫抗性表明，MCM6转录物在高盐和冷胁迫下上调，而在ABA、干旱和热胁迫下不上调[30]。而本研究通过对玉米中MCM家族基因的非生物胁迫研究表明，ZmMCM基因表达在NaCl和ABA胁迫下被明显抑制，在PEG、高温以及低温处理下基因不同程度响应胁迫，尤其是对低温具有明显应答，玉米中MCM6表达也是如此。这说明不同物种中的MCM基因在应对非生物胁迫方面有所差异。

拟南芥MCM2和MCM7基因以及玉米MCM3和MCM6基因在部分增殖组织中表达较高，有助于促进细胞分裂，满足分生组织的生长需要[15,17-18]。Ni等[31]的研究显示，ATMCM2过表达对细胞内复制有抑制作用，但对细胞增殖没有影响。以上研究表明MCM家族基因可能在有丝分裂调控中发挥作用。然而，MCM2作为DNA复制的正调控因子，按理说MCM2基因过表达会增加内复制程度，Harada为这种悖论提出了解释，他认为MCM2过表达可能影响pre-RC亚基间的化学计量数，从而导致DNA复制受到损伤，最终参与DNA复制负调控。因此，MCM2可能是DNA合成起始的速率限制因素[32]。从水稻中分离出的MCM2蛋白与酵母MCM2突变体互补，说明MCM2蛋白在功能上具有相似性[33]。目前，玉米中MCM2蛋白的作用机理尚不清楚。因此，本研究从玉米中分离出MCM2基因，并将其转化进拟南芥，探究其过表达对拟南芥生长发育的影响。结果表明MCM2基因的过表达延长了G2期，从而延迟内循环发生，导致植株表型发生改变。研究结果与拟南芥和水稻MCM2的结果一致[31]，表明MCM2蛋白在物种间具有一定的保守性。

MCM2蛋白含有核定位序列(NLS)。目前只有裂殖酵母、芽殖酵母和小鼠中证实了MCM2的核定位特性。植物MCM2蛋白定位研究较少，本研究对ZmMCM2进行定位的结果表明， ZmMCM2蛋白表达于细胞核，与前人研究结果一致[34]，可能是因为MCM2蛋白的主要功能是将具有酶活性的MCM6和其他MCM蛋白带入细胞核，这与其要行使的功能相一致。此外，本研究还通过酵母双杂交技术，利用cDNA文库筛选出一个与ZmMCM2相互作用的细胞周期分裂蛋白CDC73，为下一步更深入的分子互作机理奠定了基础，相关研究尚未见报道。