水温、流量、发育时期及孵化密度对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率的影响

2022-09-01孙丽慧陈建明姜建湖高令梅郭建林

四川农业大学学报 2022年4期

孙丽慧，李倩，陈建明，姜建湖，高令梅，郭建林

（浙江省淡水水产研究所/农业部淡水渔业健康养殖实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室，浙江湖州 313001）

澳洲淡水龙虾学名红螯螯虾(Cherax quadricari⁃natus)，又称澳洲小青龙，属于甲壳纲、十足目、长尾亚目、拟河虾科、光壳虾属，原产于澳大利亚北部的热带地区和新几内亚南部的溪流中，外形与克氏原螯虾(Procambarus clarkii)相似[1]，是世界名贵经济螯虾类之一[2]。其肉质细嫩，味道鲜美，可食率高，随着人们生活水平的提高，该虾产业规模也得以迅速扩大，市场前景十分广阔[3]。

澳洲淡水龙虾为一年多次产卵类型，目前繁育主要采用亲本自然孵化方式。由于其怀卵量较少，而且受精卵发育同步性较差，导致苗种规格差异大，出苗率不稳定，严重影响产业的发展。受精卵离体孵化技术是一种新型的生产虾蟹类幼苗的技术，该技术主要解决虾蟹类抱卵孵化时间过长，孵化过程中存在水质条件不稳定等因素易导致出苗率偏低的问题[4]。如克氏原螯虾受精卵在卵Ⅱ期进行离体孵化，其孵化率可达87.25%[5]；日本米虾(Caridina japonica)胚胎发育至膜内溞状幼体期离体孵化可获得80.7%的孵化率[6]；波纹龙虾(Panulirus homarus)心跳期胚胎离体孵化率为80.0%[7]。近年来，有报道称可采用ZISS孵化器(图1)、Hemputin孵化设备等进行澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化生产幼苗[8-13]，但关于其适宜的离体孵化条件研究较少[4]。本研究拟通过研究水温、流量、发育时期和孵化密度对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化的影响，以确定澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化的适宜条件，完善高效的澳洲淡水龙虾离体孵化技术，为进一步提高澳洲淡水龙虾虾苗规模化生产提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验采用的澳洲淡水龙虾受精卵均来自体质健康的抱卵虾，饲养于浙江省淡水水产研究所综合试验基地。水温、流量和孵化密度试验采用复眼色素形成初期虾卵（产卵后20 d）（图2），不同发育时期受精卵采用前无节幼体期（产卵后15 d）（图3）、复眼色素形成初期和孵化准备期（产卵后30 d）（图4）受精卵。

图2 澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵Figure 2 Fertilized egg at the early stage of compound eye pigment formation

图3 澳洲淡水龙虾前无节幼体时期受精卵Figure 3 Fertilized eggs at tthe egg-nauplius stage

图4 澳洲淡水龙虾孵化准备期受精卵Figure 4 Fertilized eggs at the prepare-hatching stage

1.2 试验方法

1.2.1 水温对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率和有效积温的影响

用密齿梳轻柔地剥下处于澳洲淡水龙虾7对附肢间的复眼色素形成初期受精卵，采用ZISS孵化器（由容量为500 mL，内径80 mm，高250 mm的孵化桶、过滤海绵、硅胶管、橡胶、空气控制阀、气石和不锈钢网片等组成。通过反气举方式，使受精卵在孵化桶内均匀而轻柔地翻动），分别于水温24℃、26℃、28℃、30℃和32℃水体中进行离体孵化，水温由控温棒控制，上下波动不超过0.3℃，每个温度设3个平行，每个孵化桶中放入200粒澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵。为避免水温变化速度太快影响受精卵正常发育和试验结果的真实性，以受精卵剥离水温为基点，采取逐渐升降温的方法，使各试验组水温较平缓达到试验水温要求，以每10 min升高或降低2℃的速度达到预定的温度后恒温孵化[14-15]。试验期间孵化器中水质指标为：氨氮≤0.2 mg/L，亚硝酸氮≤0.1 mg/L，溶解氧≤5 mg/L。

试验过程中记录孵化时间，孵化率以受精卵全部孵化为准[16]，至仔虾完全孵出，统计仔虾个数，计算各孵化器孵化率。孵化率、平均有效积温及各试验温度下有效积温通过以下公式计算[17-18]：

其中，Hr为澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率(%)；Ns为孵出仔虾个数；Ne为放入受精卵个数；K为澳洲淡水龙虾受精卵孵化的有效积温(℃·h)；n为数据组数；v为受精卵发育速率，即发育时间的倒数(t-1)；T为发育期间平均水温(℃)；C为澳洲淡水龙虾受精卵发育的生物学零度(℃)；t为复眼色素形成初期受精卵至仔虾孵出所需时间(h)。

1.2.2 流量对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率的影响

采用方形塑料离体孵化装置（参照兰志祥[19]设计自主改造制作）（长×宽×高为15 cm×9.7 cm×12 cm，保持水深（3.0±0.5）cm左右，体积约0.4 L）（图5），分别在流量2 L/min、5 L/min和8 L/min条件下对澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵进行离体孵化，每个流量设3个平行，每个平行放入400粒复眼色素形成初期受精卵。试验期间保持水温（28±0.5）℃，其他水质指标及孵化率计算方法同1.2.1。

图5 方形塑料孵化装置Figure 5 Square plastic incubator

1.2.3 不同发育时期对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率的影响

选取澳洲淡水龙虾前无节幼体期、复眼色素形成初期和孵化准备期3个时期受精卵各1 200粒，随机放入9个方形孵化槽中，每个孵化槽放入400粒受精卵，每个发育时期设3个平行。试验期间水质指标及孵化率计算方法同1.2.2。

1.2.4 孵化密度对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率的影响

选取3 600粒澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵，分别按照500粒/L、1 000粒/L和1 500粒/L的孵化密度放入方形塑料孵化装置中（长×宽×高为15 cm×9.7 cm×12 cm，保持水深（3±0.5）cm左右，体积约0.4 L，即孵化槽分别放入200粒、400粒和600粒受精卵），每个孵化密度设3个平行，试验期间水质指标及孵化率计算方法同1.2.2。

2 数据处理方法

将所得数据经SPSS16.0进行统计分析，每个处理得到的数据用单因素的ANOVA软件分析，当处理组之间有显著差异（P<0.05）时，用Duncan检验比较不同处理间的平均值，试验结果以平均数（mean）表示。

3 结果

3.1 不同水温澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率和有效积温

由表1可知，水温28℃时澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率显著高于其他4组（P<0.05），水温26℃和30℃时澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率则显著高于24℃和32℃（P<0.05）。由图6可见，随着水温升高，受精卵孵化时间减少。由式(2)和(3)计算得到澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵发育至初孵仔虾的平均有效积温为9 375℃·h。各温度下受精卵发育历时和有效积温如表1所示。

图6 水温对澳洲淡水龙虾受精卵发育时间的影响Figure 6 Effects of water temperature on development time of fertilized eggs

表1 不同水温澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率和有效积温Table 1 In vitro hatching rate and accumulative temperature of fertilized eggs of Australian freshwater lobster at different water temperatures

3.2 不同流量、发育时期以及孵化密度澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率

如表2所示，不同流量下澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率依次为5 L/min>2 L/min>8 L/min（P<0.05）；由表3可见，澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期和孵化准备期受精卵孵化率显著高于前无节幼体期受精卵（P<0.05），而复眼色素形成初期和孵化准备期受精卵孵化率差异不显著（P<0.05）；如表4所示，澳洲淡水龙虾受精卵孵化密度为500粒/L和1 000粒/L时孵化率显著高于1 500粒/L（P<0.05），但1 000粒/L和1 500粒/L的孵化密度下，澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率差异不显著（P>0.05）。

表2 不同流量澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率Table 2 Effects of waterflow on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

表3 不同发育时期澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率Table 3 Effects of developmental stages on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

表4 不同孵化密度澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率Table 4 Effects of hatching density on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

4 讨论与结论

4.1 不同温度对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率和有效积温的影响

目前，有关水产动物离体孵化方面的研究主要集中在有抱卵习性的虾蟹类[6-7,20-24]。水温是水产动物胚胎离体发育的重要影响因子之一[18]。本试验中，澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率受温度影响显著，水温在24℃和32℃时孵化率显著降低，在28℃时孵化率最高，达84.04%，与C.M.Loughlin等[25]研究得出的澳洲淡水龙虾亲本抱卵孵化最佳孵化水温27℃～29℃和李进[26]研究得出的澳洲淡水龙虾亲本抱卵孵化最佳孵化水温28℃相一致。当水温较低时，澳洲淡水龙虾受精卵孵化期延长，在孵化过程中往往容易感染水霉而导致受精卵死亡[27]，而过高的水温则容易致使受精卵发育受到抑制，出现畸变甚至死亡，进而造成孵化率降低[28]。李进等[26]在对澳洲淡水龙虾抱卵孵化研究中发现，随着水温从22℃上升到32℃，孵化时间从45 d缩短至20 d，本研究中，随着水温升高，澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化时间减少，这可能是由于在适当的温度范围内，温度提高可以提高孵化酶活性，从而缩短孵化时间[29-32]，故在不影响孵化率的情况下，可适当提高孵化温度，缩短孵化时间。

生物的发育过程需要温度和时间的结合，即需要一定的总热量才能完成某一阶段的发育，这就是有效积温法则，此法则是温度与发育关系的直观体现[33]，有效积温是甲壳动物的重要生物学指标，不仅可以衡量水产动物对环境温度变化的响应，而且可为水产经济动物人工育苗的温度调控、发育历期提供重要参考[34]。水生变温动物的有效积温研究通常根据对象、环境、用途的不同，设计研究周期、范围并选择生活史中单独或者相邻阶段进行实验[34]，如王璞等[34]研究了中华绒螯蟹(Erio⁃cheir sinensis)Ⅰ期溞状幼体至大眼幼体发育阶段，夏长革等[35]研究了光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)的受精卵至棱柱幼体发育阶段，胡宏辉等[36]研究了体外培养条件下三角帆蚌(Hyriopsis cumin⁃gii)受精卵至成熟钩介幼虫发育阶段，薛素燕等[37]研究了中华原钩虾(Eogammarus possjeticus)受精卵至初孵幼体发育阶段。本试验则研究了澳洲淡水龙虾复眼色素形成初期受精卵至初孵仔虾的发育阶段，结果显示此发育阶段的有效积温为9 375℃·h。不同种类水产动物胚胎发育的有效积温不尽相同，如绒螯近方蟹(Hemigrapsus penicillatus)在5～9月高温季节繁殖旺盛，其溞状幼体发育有效积温为226.35℃·d[38]，斑节对虾(Penaeus monodonFabricius)溞状幼体发育的有效积温为1 665.55℃·h[39]，中华原钩虾胚胎发育的有效积温为137.30℃·d[37]，光棘球海胆受精卵发育的有效积温为482℃·h[35]。以上水产动物胚胎发育的有效积温差异的原因除物种不同外，还与胚胎发育所处的环境温度、阶段及生理状态有关[40]。也有学者认为，有效积温法则仅考虑到温度这一单项作为主要影响因子，忽略其他生态因子的共同作用，故存在一定的局限性[17]。因此，可根据该法则预测不同温度下澳洲淡水龙虾受精卵某一阶段发育历期，而不能将胚胎发育的有效积温当成绝对的唯一指标。

4.2 不同流量、发育时期以及孵化密度对澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率的影响

目前，有关流量对虾类受精卵孵化影响方面的研究鲜见报道，可能与自然条件下虾类为抱卵孵化，受流量影响较小有关。水流量、流速对胚胎发育影响的研究主要集中在鱼类。已有研究表明，静水孵化时，胚胎的死亡率和畸形率远高于流水孵化[41-42]，原因可能是流水孵化对受精卵的刺激有利于提高胚胎发育的质量[43]。另外，相对于静水孵化，流水可以提高水体中溶解氧含量，对受精卵发育起到促进作用[44]。李卿青等[44]研究发现当水流量从0 L/h增加到70 L/h时，中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)胚胎孵化率从28.0%提高到88.0%，而本研究中，澳洲淡水龙虾受精卵随水流量从2 L/min增加到5 L/min时，离体孵化率则从65.58%提高到85.00%，继续增加水流量，受精卵离体孵化率显著降低，可见，流量过低或过高都不利于澳洲淡水龙虾受精卵孵化。流量过低容易导致受精卵交叠在一起，从而引起部分受精卵缺氧，最终导致胚胎死亡。而流量过高则容易造成受精卵翻滚激烈，增加受精卵之间、受精卵与孵化槽内壁之间的碰撞，从而导致受精卵卵膜损伤而感染霉菌，造成孵化率降低。

陈文虎等[45]在研究河蟹(Eriocheir sinensis)离体卵发育不同时期出苗率时发现，眼点期及眼点前期之前出苗率不高，眼点期之后，心律在150次/min左右是孵化布幼的最佳时期。王吉桥等[21]则发现中华绒螯蟹胚胎发育至原肠期后，即眼点期，再进行离体孵化，其离体的胚胎离体孵化率可达68.95%，极显著高于卵裂期的48.53%和囊胚期的47.84%。本研究也表明，澳洲淡水龙虾受精卵发育至孵化准备期离体孵化率较高，达89.58%，但与复眼色素形成期离体孵化率无显著性差异，前无节幼体期受精卵进离体孵化率较低，仅为73.74%，原因可能是随着离体孵化时间延长，增加受精卵感染霉菌的几率，易导致受精卵死亡，造成孵化率偏低。孵化准备期受精卵离体孵化率高可能是此阶段受精卵即将破膜而出成为初孵仔虾，孵化过程较短，大大减少感染霉菌几率，另外，受精卵发育至孵化准备期形态已初具仔虾形态，有明显外壳，起到对受精卵的保护作用，可减少因碰撞或感染而导致的受精卵死亡。

孵化密度是影响水产动物胚胎发育的重要因素之一[46-48]。当孵化密度过大，水中氧气不足易导致胚胎发育受阻、孵化率下降等现象。彭瑞冰等[48]研究表明，随着孵化密度增加，拟目乌贼(Sepia lyci⁃das)胚胎的孵化率下降，孵化密度为3～9个/L，孵化率可达95.57%～96.67%，适宜拟目乌贼胚胎孵化；李卿青等[44]研究发现中华倒刺鲃的胚胎孵化率从孵化密度30粒/L增加到60粒/L时并无显著性变化，当继续增加孵化密度，孵化率显著降低；本研究中得出与以上研究类似的结果，即随着孵化密度升高，澳洲淡水龙虾受精卵离体孵化率显著降低，其原因一是过大的孵化密度会导致胚胎在发育过程中缺氧，二是孵化密度过高时，胚胎新陈代谢产生大量二氧化碳，使得水体pH低于孵化密度较小的水体，水体pH偏低会影响胚胎对钙离子的吸收，从而导致胚胎发育畸形[49]，同时，水体pH降低也可能是造畸形率和死亡率升高的重要原因[50]，再者，澳洲淡水龙虾受精卵为沉性卵，孵化密度过高，容易导致虾卵堆积，使得内部受精卵缺氧或滋生霉菌，从而降低受精卵孵化率。