G蛋白偶联雌激素受体在乳制品雌激素检测中的应用潜力

冯春雷，鲁丁强,2,*，庞广昌,2,*

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

牛奶及乳制品中包含多种来源的雌激素，例如奶牛产奶过程分泌的雌激素、奶牛饲养过程中人为添加的激素药物等。当环境、水体、食品中雌激素超过一定限值时，雌激素可能经食物链在人体中富集，影响人体健康。雌激素具有亲脂性，更易在动物源食品中残留，可能导致乳制品等食品中的雌激素水平超标。长期摄入这类乳制品或食品会造成大量外源性雌激素进入人体，并在体内不断累积，可能危害人体健康，因此乳制品中雌激素的分析检测十分重要。目前针对乳制品中雌激素的检测方法主要有色谱法、光谱法、免疫法和生物检测法等，其中生物检测法既能满足复杂食品基质中雌激素的检测，又能弥补传统大型仪器检测和免疫法检测的不足，在乳制品雌激素检测中具有重要作用。

大量实验发现，雌激素与G蛋白偶联雌激素受体（G-protein coupled estrogen receptor，GPER）互相作用，传递快速非基因组学信号，从而发挥多种类型的生物学效应，但目前通过膜受体GPER介导的雌激素干扰效应鲜有报道。关于GPER的研究多集中在生物和医药领域，在食品安全检测领域的报道很少。食品安全检测领域的GPER研究涉及到雌激素受体（estrogen receptor，ER）、芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）的应用。本文以GPER在乳制品雌激素检测中的应用潜力为中心，阐述GPER与雌激素以及乳制品中雌激素检测的关系，重点介绍基于雌激素信号通路的生物检测方法的研究进展。

1 乳制品中的雌激素

1.1 乳制品中雌激素的检测

1.1.1 乳制品中雌激素检测的意义

随着人们生活质量的提高，含有丰富的钙、维生素、蛋白质的乳制品逐渐成为人们生活中不可缺少的食物，乳制品市场快速发展。乳制品加工工艺的各阶段都可能受到化学污染物的污染，尤其是类固醇激素的污染，其通过食物链被人体摄入并不断积累后会影响人体健康，例如残留的雌激素会对人体的生殖器官、肝脏有一定的损害作用，也可能诱发癌症。有研究表明牛奶中含有相对较高水平的雌激素和孕酮代谢物，尤其是来自怀孕奶牛的代谢物，这些物质可能会增加患乳腺癌的风险。此外，存在于牛奶及乳制品中的己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）可能诱发儿童性早熟、子宫癌以及男性女性化，存在于乳及乳制品外包装中的雌激素双酚A（bisphenol A，BPA）会损害人体生育能力，其可能引起女性反复流产或早产和男性精液质量下降、精子DNA损伤。因此，乳制品中雌激素的检测具有重要的意义。

1.1.2 乳制品中雌激素的来源和种类

乳制品中偶尔出现高含量的天然雌激素，以及在乳制品行业中滥用或非法使用合成雌激素的情况令人担忧。天然雌激素、合成雌激素及其代谢物和其他具有雌激素活性的化合物的摄入与人体许多生殖系统疾病甚至癌症相关。有研究表明人类饮食中过量的雌激素会导致内分泌失调，甚至导致激素依赖性器官（如乳房、卵巢、前列腺和睾丸）产生癌变。由于乳制品行业的商业化需求，奶牛在怀孕期间仍对其进行挤奶作业，以提高奶牛产奶量，而这一时期的天然雌激素水平非常高，可达其妊娠前几周雌激素水平的近20 倍。在这样的条件下，雌激素可能通过乳腺进入乳汁，而巴氏杀菌也不能消除雌激素活性。先前研究发现人体对牛奶和奶制品中雌酮（estrone，E1）摄入量占人体总E1摄入量的60%～70%，这表明其余的天然雌激素摄入可能也是如此。全球每年消耗近7 108 t牛奶，并且还不包含其他乳制品（如奶酪、酸奶、奶油等），所有这些乳制品通常具有高含量的脂肪，有利于亲脂性天然或合成雌激素的存在，并且这些雌激素通常不能在生产过程中去除。Bárbara等已证明内源性雌激素E1、雌二醇（estradiol，E2）或雌三醇（esrtiol，E3）等存在于牛奶及其相关乳制品中。此外，外源性雌激素也被用于动物育肥，尽管现在这种用途在大多数国家被禁止，但仍有违规使用外源性雌激素的食品安全事件发生，因此外源雌激素残留物可能存在于牛奶及乳制品中。Meng Mei等发现大量具有雌激素活性的外源雌激素被用作牛的生长促进剂，如二烯雌酚、己雌酚或DES等。还有研究发现一种存在于谷类作物的真菌雌激素——玉米赤霉烯酮也属于外源雌激素，它能提高饲料转化效率和促进牲畜的生长率，这些外源性雌激素极可能残留在牛奶及乳制品中。其他具有雌激素活性的植物雌激素分为异黄酮类（如大豆苷元、染料木黄酮等）、木脂素类（如肠内醇、肠二醇等）、香豆素类（如香豆雌酚等）等。研究表明存在于牛饲料中的植物雌激素在奶牛瘤胃中部分代谢，被肠道吸收后一小部分植物雌激素转移到牛奶中，因此饮用牛奶时也同时摄入了其中的植物雌激素。植物雌激素可以预防人体某些癌症或骨质疏松症，但其也可能对人体健康产生负面影响，例如，植物雌激素可能干扰类固醇激素代谢。

总之，乳制品雌激素的种类大致有两种：一是奶牛在产奶过程中自身分泌的天然雌激素，天然雌激素是动物和人体内天然存在的雌激素，一般指E1、E2和E3，其中以E2作用最强，E2的化学结构使其具有生物难降解性和脂溶性，易在生物体内富集，对个体层面的危害主要包括诱发高血压、冠心病和致癌作用，临床基础研究表明E2可大大提高妇科肿瘤的发病率，也可通过胎盘对婴儿产生先天致癌作用，还会对生殖系统和免疫系统产生毒性作用；二是外源性添加的，主要包括人为添加的激素，如对不孕奶牛注射含激素的催奶液，或把外源性雌激素用作动物饲料添加剂，又或者使用含有真菌雌激素的饲料喂养奶牛。外源性添加的雌激素会干扰生物体自身雌激素的合成、分泌、结合、代谢、消解或产生类似生物体自身雌激素的作用，会对生物正常的雌激素动态平衡、繁殖、生长产生不利的影响。乳制品中不同雌激素的来源与种类如表1所示。

表1 乳制品中不同雌激素的来源与种类[29]Table 1 Sources and kinds of estrogen in dairy products[29]

1.1.3 乳制品中激素检测存在的问题

乳制品是人们广泛消费的一种重要的食品。由于牛奶和乳制品中雌激素类化合物具有雌激素效应，人们对乳制品中雌激素的检测越来越重视，但因为乳制品的复杂性，相比简单样本基质（例如水样），乳制品中雌激素类化合物的分析还未得到广泛应用，尽管少数研究分析了奶酪样品中的天然和合成雌激素。

此外，欧洲关于使用激素作为动物生长促进剂的法规中，修正指令表示禁止将具有激素活性的物质用于家畜育肥，以确保欧盟范围内的居民健康得到保障。尽管有这样的立法，但对乳制品中的雌激素类化合物未规定具体的最大残留限量，激素类物质仍有可能被滥用。有研究表明BPA等外源性雌激素会从包装材料迁移到牛奶或乳制品中，尽管许多研究报告称人类食用的牛奶中含有BPA，但关于乳制品中BPA含量和污染途径的研究数据很少。此外，目前乳制品中雌激素的检测标准也存在较多问题，如雌激素种类涵盖范围较窄、检测方法不新颖、样品处理方法复杂、无法针对新的雌激素结构类似物或其代谢物进行检测等。

1.2 雌激素通过GPER受体传递信号

1.2.1 雌激素受体

雌激素通过ER和GPER分别介导的基因组途径和非基因组途径来发挥生理功能（图1）。雌激素发挥其生理功能的经典基因组学途径是与ER结合，ER随即形成ER二聚体，之后与靶基因启动子序列内的雌激素应答元件（estrogen response element，ERE）结合从而诱导靶基因表达。非基因组途径是由GPER介导的快速信号途径，该途径包括环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途径、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、钙离子（Ca）途径等，其中主要途径为打开或关闭Ca离子通道来快速控制神经、内分泌应答。随着在体外和临床研究中发现选择性调节GPER功能的配体，以及基因敲除小鼠的应用，GPER的更多潜在作用引起研究者的广泛关注。

图1 非基因组学和基因组学雌激素信号通路Fig. 1 Non-genomic and genomic estrogen signaling pathways

基因组学途径和非基因组学途径被雌激素激活，通过细胞核内控制众多基因转录、剪切、翻译、加工和转运或通过控制离子通道开关来产生一系列与代谢调节组织相关的生理影响。例如：染料木素通过调节ERβ的表达来发挥抗癌作用，它可以减少ERβ基因的启动子甲基化，从而增加ERβ整体表达。香豆雌酚可以上调ERβ的表达，激活肠内ERβ信号通路，诱导细胞凋亡，Williams等已发现香豆雌酚可减少小鼠的小肠黏膜肿瘤数量和结肠肿瘤数量。雌激素可通过经典基因组学途径（即结合ERα或ERβ）或通过非基因组学途径来激活MAPK或丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）信号通路促进局部异位组织的生长，从而导致子宫内膜异位症的发生。

1.2.2 与GPER作用的雌激素分类

GPER的配体种类分布广泛，目前仍处于研究阶段。许多作用于ERα或ERβ的配体也可以作用于GPER。目前最广泛使用的GPER特异性激动剂是G-1。常见的GPER非特异性激动剂包含天然配体E2，据报道，E2在3～6 nmol/L范围内对GPER有结合亲和力，此外，合成（工业、农业和药理学）和天然（植物和真菌雌激素）的一系列外源雌激素也能作为GPER激动剂发挥作用，如植物雌激素黄豆苷元、白藜芦醇、染料木黄酮以及环境雌激素如塑料制品中常见的BPA及化工原料壬基酚（nonyl phenol，NP）等，值得注意的是，他莫昔芬和雷洛昔芬也是GPER激动剂。GPER的特异性拮抗剂包括G-15和G-36，非特异性拮抗剂包括体内雌激素的中间代谢产物2-羟基-17-E2。

2 乳制品中雌激素的检测方法

过去几十年以来，相关研究人员一直致力于开发更灵敏、更准确的乳制品中雌激素检测方法。目前乳制品中雌激素检测的主要手段有色谱法、光谱法和免疫法等，但只适于检测已知结构的雌激素，而雌激素浓度极低以及雌激素的结构相似性限制了这些方法的应用。此外，色谱法需要对样品进行预处理，耗费时间较长，同时方法的准确性也会下降，并且色谱法所需仪器价格高，占地面积大，需要专业人员操作，通常需进行复杂的洗脱程序，该过程需要大量的有机溶剂和很高的检测成本。而光谱法，如拉曼光谱分析，虽然是一种强有力的痕量检测和识别技术，但其信号稳定性和重复性较差，耗时长。免疫法根据抗原抗体的特异性结合对样品中的雌激素物质进行检测，该方法灵敏度高，成本低，操作简单，但可检测物质种类有限，并且可能发生交叉反应造成检测结果不准确。而以雌激素信号通路为基础的生物检测方法可以满足对乳制品中雌激素及雌激素类化合物的特异性筛选，同时还可以弥补上述方法的不足。

2.1 体内实验和细胞增殖实验

最早的雌激素生物检测方法为体内实验，其中子宫营养实验和肝细胞卵黄蛋白原（vitellogenin，VTG）生成实验是我国环境中筛选雌激素及雌激素类似物的常规方法，后来为了提高对雌激素及雌激素类似物的检测效率，建立了一种基于雌激素及雌激素类似物对靶细胞增殖影响的细胞增殖实验（estrogen screen assay，简称E-Screen方法）。

子宫营养实验是一项较为经典的用于检测雌激素活性的体内实验，2001年就出现了以子宫营养实验作为检测具有类雌激素功能的内分泌干扰物的方法。由于子宫含有丰富的ER并且其功能由女性类固醇激素调节，故被用作检测雌激素的经典靶器官。子宫营养实验通过观察雌激素和雌激素类化合物对啮齿类去势成年雌鼠或幼雌鼠子宫的作用，以两个指标（子宫湿质量和子宫与体质量的比率）来衡量。该方法操作简易方便，但存在耗时长、费用高、重现性较差等缺点。子宫营养实验被认为是用于评价内分泌干扰物的雌激素活性的黄金标准，至今仍被广泛应用，Russo等通过该方法评价乳制品、食品包装和婴儿奶瓶等食品或食品器皿中的雌激素，并证实了多种具有雌激素效应的物质。黄毅娜等采用该方法证实了BPA具有弱雌激素效应。Nielsen等等采用了该方法首次研究了雌马酚含量高或低的牛奶（分别来自食用红三叶或苜蓿的奶牛的牛奶）的雌激素活性。Yamasaki等采用该方法测定了NP等23 种化学物质的雌激素效应，从中发现BPA、染料木黄酮等多种化学物具有弱雌激素活性。

肝细胞VTG生成实验以VTG作为筛选雌激素和雌激素类似物的标记物，VTG是由卵生脊椎动物鸟类、两栖类、鱼类或爬行类的肝细胞合成的一种蛋白质。VTG通常由雌性动物产生，雄性动物体内VTG的含量往往很低，但当雄性动物或幼年动物在接触到低剂量的雌激素和雌激素类似物后会诱导体内VTG的生成，故该实验以VTG作为筛选雌激素和雌激素类似物的标记物。Li Xiaoqi等使用未被环境雌激素污染的雄性鲫鱼中分离的原代肝细胞作为培养模型，以雄性鲫鱼原代肝细胞产生的VTG浓度为验证指标，发现E2和对苯二甲酸二甲酯均可诱导雄性鲫鱼原代肝细胞产生高浓度的VTG。BPA可通过ER介导途径诱导雄性鱼肝脏中VTG的表达。此外，王宏元等的研究证实NP通过上调ER而诱导雄性中国林蛙肝细胞合成VTG，并且说明了NP虽然存在明显的雌激素效应但其雌激素活性远低于E2。

早在1995年，Soto等用源于人乳腺癌的MCF7细胞进行细胞增殖实验来评价受试物的雌激素活性。用于细胞增殖实验的细胞株包括大鼠子宫原代细胞，大鼠垂体原代细胞和来源于人乳腺癌的MCF7、T47D细胞等，由于MCF7细胞株对外源性雌激素比较敏感，故用到的也最多。许多研究表明，雌激素和雌激素类化合物与ER互作后可介导乳腺癌细胞的增殖。常艳等分别以增殖力、相对增殖力和相对增殖效应3 个指标来评价雌激素化合物活性的强弱，成功地建立了E-Screen方法，并通过该方法可以检测到1×10mol/L的E2。此外，E-Screen方法可以检测存在于泥土、水、食物中的具有雌激素活性的外来化合物。董力等通过E-Screen方法发现多氯联苯和E2有明显刺激MCF-7细胞增殖的类雌激素活性，证实了多氯联苯有类雌激素样活性。Molina-Molina等在MCF-7细胞中使用E-Screen方法证实了玉米赤霉烯酮及其代谢物是ERα的激动剂并评估了它们的雌激素作用。

用于雌激素检测的体内实验和E-Screen方法各具优势和不足，子宫营养实验虽然具有高可靠性、操作简易的优点，但其所需时间较长，不适宜大量筛选，并且重现性较差。此外，肝细胞VTG生成实验具有灵敏度高、操作方便等优点，但其应用会因为雌性动物体内存在天然卵黄而受到一定限制。与上述方法相比，E-Screen方法更为灵敏，通常结合体内实验确保结果的可靠性，用MCF7细胞进行细胞增殖实验所得的检测结果可信度较高，因为MCF7细胞来源于人，排除了动物实验的不确定性，但该方法所需实验条件、培养基和血清都有特殊要求，因此实验条件和成本较高。

2.2 生物传感器

近年来，生物传感器在环境和食品中的雌激素检测方面发挥着巨大的作用，这主要由于生物传感器具有高灵敏、分析快、低成本和高度自动化等优点。但目前生物传感器主要用于环境水样中的雌激素检测，很少用于牛奶、蜂蜜等食品基质中雌激素的检测，并且若将检测雌激素的生物传感器商业化，还面临着从实验室走向市场后的诸多问题。目前用于检测乳制品中雌激素的生物传感器有很多种：电化学生物传感器、光学生物传感器、光电化学（photoelectrochemistry，PEC）生物传感器、荧光细胞生物传感器以及其他生物传感器等。

2.2.1 电化学生物传感器

电化学生物传感器以生物活性物质为生物识别元件，加入待测物质后，修饰在电极上的生物识别元件会和待测物质结合，导致生物识别元件的结构或活性发生改变，进而通过信号转换器将生物学变化转变为电学信号实现对待测物的定量检测。该方法具有检测速度快、抗干扰能力强、响应好和灵敏度高的特点，被广泛应用。

电化学生物传感器根据生物识别元件的不同又可以分为抗体电化学生物传感器、适体电化学生物传感器、酶电化学生物传感器等。近年来，抗体电化学生物传感器被大量开发用于外源性雌激素的快速检测。由于免疫反应的高特异性和电化学分析技术的高灵敏度，基于抗原-抗体特异性结合的抗体电化学生物传感器具有一些优点，例如快速和简单，通常具有良好的灵敏度和选择性，但存在稳定性差等缺点。Pan Guangpin等采用纳米效应、层间自组装和抗原-抗体特异性免疫技术相结合的设计策略，成功将己雌酚固定在玻碳电极的表面构建了抗体电化学生物传感器，该传感器可同时用于检测4 种酚类雌激素：己雌酚、DES、二烯雌酚和BPA，检测限分别为0.25、0.25、0.15、0.2 ng/mL（信噪比为3），并且在对奶粉等实际样品中的二烯雌酚进行检测时，该生物传感器具有实际可行性，结果良好。此外，由于适体相对稳定且易于合成，适体电化学生物传感器正日益取代传统的抗体电化学生物传感系统，Ma Yibo等制作了一种基于DNA的电化学生物传感器，该生物传感器对BPA检测的线性范围和检测限分别为1.0×10～1.0×10mol/L和7.2×10mol/L，并且该传感器能检测到牛奶中微量的BPA（10～10mol/L），回收率为92%～108%。与抗体生物传感器和适体生物传感器相比，酶电化学生物传感器在复杂的食品基质或水样中具有更好的稳定性，然而，基于酶作为识别元件的传感系统具有相对较差的特异性，并且更适合检测具有雌激素特性的物质。Kochana等采用酪氨酸酶被包埋的技术制作了一种酶电化学生物传感器，该生物传感器可在奶瓶中检测到BPA，检测限为6.6 nmol/L。

2.2.2 光学生物传感器

光学生物传感器是生物传感器的一个分支，其原理是利用光（电磁辐射/波）与目标分析物的相互作用来测定目标分析物的浓度，光（电磁辐射/波）与目标分析物相互作用通过吸附、散射（吸收和再发射光）、折射率变化和荧光来实现对目标分析物的定性以及定量分析。根据光（电磁辐射/波）与目标分析物相互作用过程中光学信号的不同，光学生物传感器可以分为不同类型：荧光光谱型、化学发光光谱型、表面等离子共振光谱（surface plasmon resonance，SPR）型等。

随着高特异性的分子识别元件与具备优异光学性能的新型纳米材料的结合，荧光生物传感器在雌激素检测领域的应用潜力备受研究者瞩目。Ren Shuyue等开发了一种荧光生物传感器用于同时检测复杂样品中的BPA和E2，BPA和E2的检测限分别为7.8 pg/mL和92 pg/mL，该生物传感器可用于牛奶样品中BPA和E2的测定，回收率分别为93.76%～107.12%和87.91%～106.4%，但该方法通常特异性有限，荧光基团易受干扰，在光漂白过程中会失去发出荧光的能力。此外，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）生物传感器在雌激素检测中也具有广阔的应用前景，Zhang Huifang等研制了一种用于检测饮料样品中BPA的ECL生物传感器，待测物中的BPA浓度越高，ECL信号就会越强，该传感器对BPA检测的线性范围为2 pmol/L～50 nmol/L，检测限为1.5 pmol/L，并且该传感器可用于牛奶、橙汁和椰汁样品中BPA的测定，回收率在96%～105%，这表明ECL生物传感器在检测实际样品中BPA方面具有实际应用性，结果良好。虽然ECL生物传感器具有检测限较低、应用范围广、无背景散射光信号等优点，但其无法实现现场即时检测。基于SPR的光学生物传感器和新型免疫层析生物传感器也用于乳制品中雌激素的检测，Habauzit等基于SPR技术研制了一种无标记的SPR光学生物传感器，以ERα和ERE作为生物识别元件，将其固定在生物芯片的金属膜上。当受试物中含有雌激素时，雌激素会迅速形成不稳定的ER/ERE复合物，改变ER与ERE之间的相互作用，通过检测结合效率和络合物稳定性的差异来评估雌激素活性。目前，该生物传感器已应用于乳制品等食品包装中BPA的检测，检测限为5.2 pg/mL。Lu Lixia等用光热材料黑鳞构建了一种便携式的新型免疫层析生物传感器，该传感器用黑鳞标记的抗E2的抗体作目标分析物的识别元件，由近红外光照射黑鳞产生的温度作输出信号，在用于牛奶样品中E2的检测时该传感器的检测限为0.104 ng/mL，该传感器具有便携、成本低、操作简单、测定时间短等优点，但稳定性有待提高。

2.2.3 光电化学生物传感器

PEC生物传感器被广泛认为是一种新颖的生物分析技术，因为与传统方法相比，生物分子具有更好的固有灵敏度和特定的生物亲和性特征。PEC生物传感器的检测原理是基于光电活性物质的光电转换特性来确定被检测生物标志物的浓度。在PEC检测过程中，光被用作激发信号来激发光敏物质，而电信号被用作检测信号。因此，PEC分析技术不仅延续了电化学生物传感器的优点，如响应速度快、成本低、稳定性高等，同时相比各种光学技术也具有更高的灵敏度、更简易的操作等优势，PEC生物传感器在乳制品等食品中雌激素的检测中具有巨大的潜在应用前景。Du Xiaojiao等把E2适体作为痕量E2分析的识别元件构建了一种PEC生物传感器，在该传感器的最佳检测条件下，E2检测的线性范围为1×10～1×10mol/L，检测限为3.3×10mol/L，此外，该生物传感器对添加不同浓度E2的奶粉样品进行了测定，回收率为86.96%～102.94%，相对标准偏差为2.3%～7.4%，证明了其在乳制品中雌激素检测的可行性，然而，PEC生物传感器仍处于起步阶段，其持续发展仍面临诸多挑战。新型PEC活性材料与生物识别元件结合建立的新测定体系，将进一步拓展PEC生物传感方法的应用空间。

2.2.4 细胞生物传感器

基于细胞的生物传感器是由细胞作为敏感捕捉细胞生理反应的传感元件和传感器组成的。近年来，随着荧光分析方法和技术的进步，众多报告基因中的荧光素酶和荧光蛋白基因被备受关注，该技术结合迅速发展的细胞生物传感器在基于雌激素效应途径的基础上可实现对乳制品中雌激素的定量测定，该方法具有灵敏度高、响应速度快等优点。

近年来被广泛用于雌激素活性筛选的重组酵母测评系统（recombinant yeast estrogen system，RYES）的原理是将哺乳动物ER、ERE和-半乳糖苷酶（）的基因重组于酵母细胞，当待测物具有雌激素样作用时，会产生依赖于雌激素浓度的可量化信号。在RYES技术的基础上，有研究以荧光素酶基因作为报告基因，构建稳定表达ERE的重组HeLa细胞株用于检测食品中雌激素样物质的含量，E2的加标回收率均在75%以上，相对标准偏差为7.3%～11.6%，具有较高的精密度，但由于对荧光素酶的检测需要预先对细胞壁进行破坏，故操作步骤比较复杂；还有研究基于绿色荧光蛋白表达的酵母对雌激素进行快速生物测定，但该方法与商业化的生物传感器相比速度较慢，通常需要几个小时才能完成。荧光细胞生物传感器不仅可以作为动物源性食品中雌激素活性的快速筛选方法，而且还可用于对牛奶等乳制品中雌激素的测定。

2.2.5 其他的生物传感器

除了上述生物传感器用于乳制品中雌激素检测外，真菌生物传感器和受体型生物传感器也被广泛应用。Christoph等开发并验证了一种用于检测雌激素活性的真菌生物传感器，该传感器使用丝状真菌构巢曲霉（）的一种经工程改造的遗传修饰菌株，在奶牛所产生的牛奶、尿液和粪便中的雌激素检测中得以应用，与酶免疫分析所得结果一致，对于17-E2，该生物传感器显示的检测限为1 ng/L，真菌生物传感器检测比基于酵母细胞系统更快，后者需要3～4 d才能获得读数。Im等首次将ERα结合生物传感器应用于雌激素的检测，该传感器是通过将ER固定在金电极修饰表面来实现的，通过逐步的电化学阻抗谱和X射线光电子能谱的测量，发现在磷酸盐缓冲液中，将受体修饰电极暴露于10mol/L的雌激素中可以观察到阻抗的变化。许冰等采用纳米金修饰双层类脂膜（bilayer lipid membrane，BLM）来固定ERα，制成Pt/BLM/Au/ER电极，利用电化学阻抗法检测雌激素，当该电极与雌激素结合后，交流阻抗法测得的阻抗与17-E2质量浓度在5～150 ng/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.996，检出限（信噪比为3）为1 ng/L。

2.3 乳制品中雌激素检测方法的优势及不足

目前乳制品中雌激素检测的主要手段有色谱法、光谱法和免疫法等，但由于雌激素在极低浓度下存在以及雌激素的结构相似性，这些方法只能检测出已知结构的雌激素。色谱法检测精度比较高，但存在如仪器价格高、操作复杂等缺点，此外，光谱法虽然是一种很好的痕量检测技术，但该方法稳定性和重复性较差，免疫法虽然有更高的检测效率，但可检测物质种类有限，并且可能还会发生交叉反应造成污染。而基于雌激素效应途径的生物检测方法可以检测复杂基质的雌激素活性，弥补了色谱法、光谱法和免疫法的不足，可评价已知和未知物质、单一组分或混合物的雌激素效应，具有较高的特异性。但该方法在单组分检测精度方面不如色谱法和免疫法。各检测方法在检测乳制品中雌激素残留方面的应用对比如表2所示。

表2 乳制品中雌激素的检测方法Table 2 Summary of methods used for estrogen detection in dairy products

3 GPER在乳制品雌激素检测中的应用潜力

GPER介导快速非基因组学途径，雌激素与GPER识别、变构，将此变构作用联动到胞内与G蛋白偶联引起信号级联放大来发挥多种类型的生物学效应。多项研究表明，雌激素及雌激素类化合物进入人体后扰乱了人体内的信号通路，但目前通过膜受体GPER介导的雌激素干扰效应并未得到广泛关注，并且很多用于乳制品中雌激素检测的方法是基于对其本身浓度的测定，与受-配体识别、细胞信号传递或动物神经信号传导无关，而且动物实验和细胞实验也很难代表人体功能，其实验结果也很难供人体参考。故基于研究受配体互作、胞外与胞内间联动变构、胞内信号级联放大及传递的全过程并从受体的角度对乳制品中雌激素进行功能评价才是可行的，但到目前为止并未见基于GPER来检测乳制品中雌激素的相关报道，也未见有关GPER生物传感器的相关报道，即使有多个研究通过ERα构建了生物传感器来检测水中的环境雌激素。根据笔者所在实验室近年在受体传感器方面进行的系统研究，人类GPER分子组装构建电化学传感器有望对乳制品中雌激素及雌激素类化合物进行定量化测定及功能评价。

4 利用GPER检测雌激素（雌激素类化合物）需解决的科学问题

近年来，虽然关于GPER的研究已经很多，但未发现有利用GPER检测雌激素（雌激素类化合物）的相关研究。假设基于GPER构建一个受体型电化学生物传感器来检测乳制品中雌激素，仍存在一些需要解决的问题。1）生物传感器修饰过程一般都需要若干个步骤以固定所需的生物活性分子，而且传感器自身电学特性也存在差异，这使得同一批次制备的生物传感器对同一浓度标准品溶液的电化学响应也会存在偏差。这些微小的偏差在传感器商业化过程中不可避免地被放大，影响最终检测结果，进一步引起用户对仪器准确度的担忧。2）尽管大量研究都已揭示GPER与诸多生理作用相关，并开发出一系列药物如治疗乳腺癌的药物，如氟维司群、他莫昔芬，却一直未有研究获得确切的GPER晶体结构，更未获得雌激素或雌激素类化合物“敲击”GPER时的互作过程，仅有的报道是基于分子建模模拟破译GPER激动剂和拮抗剂相互作用的分子识别特性，这为证明雌激素或雌激素类化合物如何作用于GPER的作用机制带来诸多困难。冷冻电子显微镜技术的兴起为解析GPER的精确结构和研究受-配体互作过程提供了新途径，但雌激素或雌激素类化合物与GPER的作用类似于“敲击键盘”的过程，雌激素或雌激素类化合物“敲击”GPER的某个结构域后在短时间内改变GPER的构象从而传递信号到胞内进而激活胞内相关信号或代谢途径，那么极低浓度的配体是如何激活受体下游信号的问题很难让人忽视。3）目前用于乳制品中雌激素检测相关的ER型电化学生物传感器的研究成果较少，尽管有相关成功的报道却少有后续进展。4）目前大多数生物传感器主要用于检测环境水样中的雌激素，很少直接用于牛奶和蜂蜜等食品基质中雌激素的检测，而且当前已开发的生物传感器并未广泛开发用于商业用途。

5 结 语

乳制品是当今世界人们广泛消费的一种重要的食品。乳制品中包含多种来源的激素，其中最值得关注的是雌激素。乳制品中的雌激素进入人体通过雌激素信号途径干扰人体内分泌系统，从而产生不良的生物学效应。乳制品中雌激素的有效检测一直是相关研究的热点。由于雌激素物质化学结构的多样性，仅根据其分子结构来分析预测雌激素活性具有一定的局限性，而生物检测方法将在乳制品雌激素检测中扮演重要的角色。该方法不仅可以检测复杂食品基质中的雌激素，还解决了传统大型仪器检测和免疫方法的不足，但其在单组分准确测量和检测精度方面有所欠缺，需在今后得到解决。

当前乳制品中雌激素的检测方法主要基于对雌激素本身浓度的测定，与受-配体识别、细胞信号传递无关。而动物实验和细胞实验很难同步到人体功能，其结果也较难供人体参考。GPER是介导快速非基因组学途径的雌激素膜受体，已有ERα生物传感器检测水中雌激素的研究，因此可将GPER应用于乳制品中雌激素的检测，如将人类GPER分子组装在电极表面，制成电化学受体传感器，从而对乳制品中雌激素进行定量化测定和功能评价。此外，未来的乳制品雌激素检测手段应更加便携化、自动化、数据化。例如，生物传感器的检测结果可直接发送并呈现在移动设备端。因此设计一款检测乳制品中雌激素的理想型生物传感器需要在多方面投入更多的精力。