LED蓝光处理对小麦粉的减菌效果及其品质的影响

王子元，李婉怡，马子楚，赵 萌，王静涵，张 敏

（北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

小麦粉作为一种重要的加工原料粉，其需求量大，是全球最重要的主食原料粉之一。然而小麦粉的品质易受到外界环境影响，如种植区域、气候状况、储存条件等；且小麦粉在储藏过程中暴露在空气中，由于其组织松软、无外壳保护，易受微生物污染，导致微生物超标，造成粮食损失。其中霉菌污染会造成小麦粉霉变，使其品质下降，甚至会产生真菌毒素，危害食用者的身体健康；而其他病原性细菌可引起食源性感染和食物中毒。Berghofer等研究发现澳大利亚小麦粉中的微生物主要包括芽孢菌群、大肠菌群、霉菌和酵母等。吴国锋研究表明我国小麦主产区小麦粉的微生物污染状况与Berghofer等的研究结果相似；其中，小麦粉中大肠菌群典型数值为2（lg（CFU/g）），芽孢菌群典型数值为3（lg（CFU/g）），大肠菌群检出率高达100%，蜡样芽孢杆菌检出率为94.35%。曾朝珍等研究了小麦粉生产过程中微生物的变化规律，结果表明在小麦粉的生产过程中蜡样芽孢杆菌含量均高于1（lg（CFU/g））。郭祯祥等对小麦粉生产过程中微生物污染关键点进行了研究，结果发现在小麦粉中的大肠杆菌含量均高于2（lg（CFU/g））。李彪、谭静等调查分析了微生物对小麦及其加工品的污染情况，结果发现小麦粉中的细菌多为杆菌，且革兰氏阳性杆菌中有芽孢的占比较多。我国规定小麦粉中致病菌以蜡样芽孢杆菌（）、大肠杆菌（）等作为参考菌群，其含量超标均可造成食品安全隐患。

现有应用于小麦粉的减菌处理技术主要包括微波处理、臭氧处理、电子束辐照、紫外辐照处理等。然而微波容易受热不均，造成部分小麦粉因过度加热而糊化，影响原料品质；且微波的热效应可引起一系列不可控的化学反应，导致蛋白质变性、非酶褐变、维生素和营养成分的损失。臭氧气调处理技术是利用臭氧的强氧化性达到杀菌目的，但过量的臭氧会影响食品风味，造成食品氧化，且成本相对较高。紫外辐照虽然是一种常见的灭菌方式，但存在不安全因素，可造成人体皮肤损伤。

LED光照处理是一种新兴的非热减菌技术，近年来受到越来越多的关注。LED处理采用半导体技术，利用半导体形成特定波长的光，其不需要预热、散发热量少并且能够保持光照强度不变。此外，LED所需电压较低，具有寿命长、节能、高效、耐久性高、环保等优点，同时易于与现有的处理技术相结合，因此LED处理技术是极具应用潜力的杀菌技术。LED冷处理技术已被报道应用于不同食品中食源性病原体的灭活，然而鲜有将LED光照处理应用于小麦减菌并研究其对小麦品质影响的报道。因此，本研究选取小麦粉中检出率较高的革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌），研究LED蓝光处理技术对不同筋度小麦粉的灭菌效果，同时研究其对小麦粉理化性质的影响。研究结果将为提高食品安全、解决由于小麦粉微生物污染而导致的面制食品安全问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金沙河高筋小麦粉、中筋小麦粉、低筋小麦粉（蛋白质量分数分别为12.2%、12.2%、8.8%）购买于京东商城；不加碘食盐购于当地零售超市。

蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌由本实验室保存。

LB营养琼脂、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲液、无水乙醇均购于北京半夏科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

JA21001电子天平 上海菁海仪器有限公司；GR85DF高压灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；DHP-9162恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；BCL-1360A超净工作台 北京亚太克隆仪器技术有限公司；Infinite M200酶标仪 帝肯（上海）贸易有限公司；SU8220扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将冻存于-80 ℃的菌液接种于100 mL新鲜LB液体培养基中，将其置于摇床（37 ℃）上培养12～14 h，然后划线接种于LB平板上，37 ℃恒温培养24 h得到单菌落。挑取单菌落于LB液体培养基中，37 ℃培养12 h。培养后的菌液离心（5 000 r/min、10 min、4 ℃）并弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.4）使菌体复悬，制得菌悬液。

1.3.2 小麦粉接种

参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定小麦粉中的初始菌落数。

将2 mL含不同菌落数的大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌菌悬液分别加入装有10 g小麦粉的无菌聚乙烯取样袋中，用手按压3 min，然后将接种的小麦粉于室温下（25℃）风干2 h，混匀。随机选取3 个1 g样品，按照GB 4789.2—2016方法测定小麦粉中菌落数，小麦粉中接种菌落数最终分别约为6 （lg（CFU/g））（高接菌量）和3（lg（CFU/g））（低接菌量）。

1.3.3 LED光照处理

在室温下（25 ℃）将接种后的小麦粉置于无菌培养皿中，培养皿置于LED蓝光灯（波长为430～470 nm，功率为36 W，光照面积为706.5 cm，光功率密度为50.955 mW/cm）正下方15 cm处，小麦粉厚度为0.5 cm，分别光照处理1、2、3、4、5 h，设置光照0 h为对照组。每小时取1 g小麦粉放入无菌均质袋中，并加入9 mL质量分数0.1%蛋白胨溶液，均质机拍打3 min，制成匀浆。使用无菌磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.4）对匀浆进行梯度稀释，涂布于LB平板，每个稀释梯度做两个平行，37 ℃恒温培养24 h后记录平板菌落数，以此来确定LED蓝光光照对小麦粉中微生物的影响。再以相同的LED光照处理条件处理未接种的小麦粉，按相应的方法测定小麦粉的理化指标。

1.3.4 小麦粉理化指标测定

1.3.4.1 水分质量分数

水分质量分数参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行测定。

1.3.4.2 水分状态测定

将LED蓝光处理不同时间和在自然环境下放置不同时间的小麦粉放置在直径1.50 cm 的核磁专用测试管中，选择CPMG序列扫描测定面条的横向弛豫时间。参数设置：采样频率为200 kHz，等待时间为1 000 ms，回波个数为1 000，回波时间为0.125 ms，累加次数为32，测定结束后进行反演并导出数据，每个样品测定3 次，取平均值。

1.3.4.3 色泽测定

选取LED光照处理不同时间和在自然环境下放置不同时间的小麦粉，采用色差仪测定样品的值（亮度）、值（红绿度）、*值（黄蓝度）。每个样品重复测定5 次，除去最大值和最小值，取平均值。数据采自3 次独立重复的平行实验。

1.3.4.4 湿面筋质量分数测定

参照GB/T 5506.1—2008《小麦和小麦粉 面筋含量》测定湿面筋质量分数。

1.3.4.5 蛋白质聚合体测定

采用质量分数12%分离胶及5%浓缩胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）实验。取不同处理组小麦粉样品20 mg分别加入1 mL 0.01 mol/L Tris-HCl提取缓冲液（pH 6.8，包括10 g/100 mL SDS、10%（体积分数，下同）甘油、0.1 g/100 mL溴酚蓝）中。将样品在100 ℃沸水中煮5 min，然后8 000×离心5 min。取15 μL各样品上清液注入上样孔槽中，在100 V下进行电泳。当染料前沿电泳至离橡胶框底边约1 cm时，停止电泳。用0.2%考马斯亮蓝R250（溶剂含25%甲醇和10%乙酸）染色30 min后用脱色液（含40%甲醇和10%乙酸）脱色。用FUSIONN FX凝胶成像系统进行拍照，保存图像。

1.3.4.6 微观结构测定

采用扫描电子显微镜对不同处理组小麦粉颗粒形态进行观察。取干燥后的少量不同处理组小麦粉样品均匀洒落在含有导电双面胶的金属圆盘上，真空条件下进行镀金处理，再将圆盘放入扫描电子显微镜下放大2 000 倍观察，选择视野清晰且有代表性的样品颗粒并拍照。

1.4 数据处理与分析

数据采用SPSS 19.0软件进行处理与分析，选择Duncan检验在＜0.05水平上对数据进行显著性分析，作图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 LED蓝光处理对小麦粉中大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的减菌效果

由图1A可知，不同LED蓝光光照时间（1～5 h）处理初始菌落数约为6（lg（CFU/g））的高筋、中筋和低筋小麦粉均能达到显著抑菌效果，且光照时间越长，抑菌效果越好。光照时间达到5 h时，高接菌量的小麦粉中大肠杆菌菌落数由6.1（lg（CFU/g））减少到约1.2（lg（CFU/g）），减少了约4.9（lg（CFU/g））。相同光照处理时间的不同筋度小麦粉之间的显著性分析结果显示，小麦粉的筋度不会影响LED蓝光对大肠杆菌的抑菌效果。由图1B可知，对初始菌落数约为3（lg（CFU/g））的不同筋度小麦粉进行LED光照处理2 h后，大肠杆菌菌落数均显著降低至约1.0（lg（CFU/g））。

图1 LED光照时间对不同接菌量大肠杆菌的减菌效果Fig. 1 Influence of LED illumination time on bacterial decontamination of wheat flour inoculated with different concentrations of E. coli

由图2A可知，高接菌量小麦粉蜡样芽孢杆菌菌落数随着光照处理时间的延长而显著减少，光照1 h后，蜡样芽孢杆菌减少约2（lg（CFU/g）），而光照处理5 h后，菌落数由初始时的6.1（lg（CFU/g））减少至约1.4（lg（CFU/g）），减少了约4.7（lg（CFU/g））。LED蓝光处理对低接菌量小麦粉的抑菌结果表明，光照处理1 h后，蜡样芽孢杆菌菌落数由3.1（lg（CFU/g））减少至约0.8（lg（CFU/g））（图2B）。由此可知，LED蓝光处理对不同筋度小麦粉中的蜡样芽孢杆菌及大肠杆菌均有显著的减菌效果，但不同菌种对LED蓝光的敏感性不同。蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，其细胞壁结构较为简单，主要由肽聚糖层组成，蓝光更容易透过其细胞结构从而起到抑菌作用；大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞壁由多层结构组成（肽聚糖层及特有的外膜层），使蓝光相对不易穿透。此结果与李峥的研究结果相一致。

图2 LED光照时间对不同接菌量蜡样芽孢杆菌的减菌效果Fig. 2 Influence of LED illumination time on bacterial decontamination of wheat flour inoculated with different concentrations of B. cereus

2.2 LED蓝光处理对小麦粉水分质量分数的影响

从图3可知，与初始水分质量分数相比，LED蓝光处理5 h后小麦粉水分质量分数降低3%左右，室温放置（25 ℃、相对湿度55%）的未处理组小麦粉水分质量分数降低1%左右。该变化可能由LED长时间照射会产生的少量热效应导致。Prasad等用395 nm LED脉冲强光处理宠物食品，研究结果表明，经过LED脉冲强光处理不同时间后宠物食品的水分质量分数显著降低，且水分质量分数与光照时间呈负相关，与本研究结果相一致。

图3 LED光照时间对小麦粉水分质量分数的影响Fig. 3 Effect of LED illumination time on the moisture content of wheat flour

2.3 LED蓝光处理对小麦粉水分分布状态的影响

水分是食品的重要组成成分，通过表征水分的性质可以了解食品的稳定性。本研究利用低频核磁共振确定LED光照处理对不同筋度小麦粉水分状态的影响。横向弛豫时间可从微观上表征小麦粉内部水分的流动性。越短说明水与非水组分的结合更为紧密，越长说明水分越自由。和分别表示强结合水和弱结合水的弛豫时间。由图4A可知，随着光照时间的延长，显著缩短，说明强结合水和非水组分之间的结合变得紧密，且在0～1 h内变化幅度较大，1 h之后趋于平缓。和分别表示和对应状态水的相对含量。由图4B可以看出，不同筋度小麦粉中强结合水所占比例较大，均高于80%，且光照时间越长，越小，即强结合水的峰面积减小。观察图5A可知，光照处理不会对高筋和中筋小麦粉的造成显著影响，表明光照处理不会影响高筋和中筋小麦粉中弱结合水与非水组分的结合紧密程度，而低筋小麦粉中随光照时间延长呈延长趋势，表明低筋小麦粉中水与非水组分的结合变得更加紧密。图5B显示光照时间对高筋小麦粉的无显著影响，即光照处理不会影响高筋小麦粉的弱结合水含量。此外，中筋和低筋小麦粉的随处理时间的延长而增加，表明LED蓝光处理后中筋和低筋小麦粉中弱结合水含量增加。

图4 不同LED光照时间条件下小麦粉T21（A）和A21（B）变化趋势Fig. 4 Changes in T21 (A) and A21 (B) of wheat flour with LED illumination time

图5 不同LED光照时间条件下小麦粉T22（A）和A22（B）变化趋势Fig. 5 Changes in T22 (A) and A22 (B) of wheat flour with LED illumination time

观察图6可知，自然环境放置不同时间的小麦粉，随放置时间的延长，不同筋度小麦粉弛豫时间减小，说明小麦粉中水分与非水组分随着放置时间的延长，结合变得紧密。3 种筋度小麦粉的峰面积均减小，说明强结合水含量随着放置时间的延长呈下降趋势。由图7可知，自然环境放置不同时间的小麦粉，随放置时间的延长，高筋小麦粉减小，而中筋和低筋小麦粉无显著变化，即高筋小麦粉中弱结合水与非水组分结合变得紧密。高筋和中筋小麦粉无显著变化，放置后低筋小麦粉显著增加，即低筋小麦粉中弱结合水含量增加。

图6 自然放置不同时间后小麦粉T21（A）和A21（B）变化趋势Fig. 6 Changes in T21 (A) and A21 (B) of wheat flour after different storage periods under natural conditions

图7 自然放置不同时间后小麦粉T22（A）和A22（B）变化趋势Fig. 7 Changes in T22 (A) and A22 (B) of wheat flour after different storage periods under natural conditions

2.4 LED蓝光处理对小麦粉色泽的影响

由图8可见，经过LED蓝光处理不同时间的小麦粉与自然环境中放置不同时间的小麦粉*值无显著变化，随光照时间延长，小麦粉*值呈现上升趋势，*值减小，即光照处理对小麦粉的亮度无显著影响，而绿度和黄度下降。自然放置5 h后的小麦粉*值，*值及*值均无显著变化。这与Du Lihui等的研究结果一致。其研究结果表明，与未经脉冲LED处理的样品相比，455 nm脉冲LED处理后的小麦粉样品的*值无显著变化，而*值增大，*值减小。

图8 不同LED光照时间对小麦粉色泽的影响Fig. 8 Effect of LED illumination time on the color of wheat flour

2.5 LED蓝光处理对小麦粉湿面筋质量分数的影响

麦醇溶蛋白和麦谷蛋白被称为面筋蛋白，不仅具有较高的营养价值，而且是小麦粉所特有的蛋白，可使面团形成独特的黏弹性结构。湿面筋是由麦谷蛋白与麦醇溶蛋白构成的蛋白质凝聚物，湿面筋含量对面团品质有着决定性的作用。根据湿面筋含量可大致区分小麦粉的用途，如湿面筋含量高的比较适合制作面包，而湿面筋含量低的比较适合制作糕点类。高筋和中筋小麦粉在市售包装上所标明的蛋白质量分数均为12.2%，但高筋小麦粉的湿面筋质量分数高于中筋小麦粉，这可能是因为不同筋度的小麦粉中麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的比例不同。当其中麦醇溶蛋白的相对含量较高时，面筋的网络结构不牢固，导致湿面筋含量减少。

图9 不同LED光照时间对小麦粉湿面筋质量分数的影响Fig. 9 Effect of LED illumination time on wet gluten content of wheat flour

由图9可知，高筋小麦粉的湿面筋质量分数约为30%，中筋小麦粉的湿面筋质量分数约为26%，低筋小麦粉的湿面筋质量分数约为20%。随着光照处理时间的延长，3 种不同筋度的小麦粉湿面筋质量分数均未呈现显著性变化，因此可知LED蓝光处理对小麦粉湿面筋质量分数无显著影响。

2.6 LED蓝光处理对小麦蛋白质聚合体的影响

SDS-PAGE可以保持蛋白形态，用于分析蛋白聚合状态。由图10可见，高筋、中筋和低筋小麦粉的蛋白电泳条带主要分布在20～40、60～70 kDa及85～120 kDa之间，且随着光照时间的延长，条带颜色变化不明显，说明各条带对应的蛋白质聚合体无明显差异。相关研究表明，麦醇溶蛋白主要分布在25～100 kDa之间，麦谷蛋白主要分布在100～120 kDa之间，因此可知小麦粉中麦醇溶蛋白和麦谷蛋白含量较多。从图10A、B可以看出，高筋小麦粉和中筋小麦粉的电泳条带灰度大体相同。由图10C可知，低筋小麦粉与高筋和中筋小麦粉相比，不同分子质量区间的蛋白条带颜色相对较浅，证明低筋小麦粉的蛋白质含量较少。与未处理组对比，LED光照处理组的电泳图没有出现蛋白质聚合体分子质量的差异，表明光照处理不会影响小麦粉中醇溶蛋白和谷蛋白的组成。

图10 不同LED光照时间处理不同筋度小麦粉的SDS-PAGE图Fig. 10 SDS-PAGE patterns of wheat flour illuminated with LED blue light for different periods of time

2.7 LED蓝光处理对小麦粉微观结构的影响

从图11可知，与未经LED蓝光处理的小麦粉相比较，LED处理后的小麦粉，尤其是在蓝光处理5 h后，其微观结构的不同组分，如蛋白-蛋白、蛋白-淀粉及淀粉-淀粉之间结合得更加紧密。Du Lihui等用395 nm脉冲LED处理小麦粉，与对照相比增强了小麦粉的蛋白和淀粉之间的相互作用，形成了更加稳定的结构，与本研究结论一致。同时也有研究表明，用稳定性强的面粉生产出来的面包、面条及馒头等食品往往具有更好的质构和口感。

图11 未处理小麦粉及不同时间LED蓝光处理的小麦粉扫描电镜图Fig. 11 Scanning electron microscopic images of intact wheat flour and LED blue light-treated wheat flour with different illumination periods

3 结 论

LED蓝光可以有效控制小麦粉中大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的菌落数，且光照时间越长，减菌效果越显著。与对照相比，LED蓝光处理会降低小麦粉的水分质量分数，同时随着光照时间的延长，小麦粉中的水与非水组分的结合更为紧密，且强结合水向弱结合水转变。LED蓝光处理后小麦粉的*值无显著变化，但*值和*值降低。LED处理对小麦粉中湿面筋的质量分数和蛋白质聚合体无显著影响，但随着光照时间的延长，小麦粉中的蛋白、淀粉之间会发生聚集，使小麦粉的稳定性提高。综上所述，LED蓝光处理技术可有效降低小麦粉中的微生物数量且不会对其他理化特性造成不利影响。