不同处理方法对蛋清蛋白免疫原性及结构的影响

王 晨，马艳秋，张梓湘，张龙媛，迟玉杰,*，迟 媛

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学工程学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

我国鸡蛋产量位居于世界第一，鸡蛋营养丰富、价格低廉，是人们日常生活中主要的蛋白质来源之一，由于其高营养价值和优良的功能特性而被广泛应用于食品工业中。但鸡蛋也是引起人体过敏最常见的食物之一，其致敏对象主要以婴幼儿和儿童为主。鸡蛋所致过敏主要是蛋清中蛋白引起的，其中最主要的4 种过敏原分别是卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶。随着鸡蛋产量的增加和应用范围的扩大，鸡蛋过敏人群数量也随之增加。因此，探究改性方法降低鸡蛋致敏性对开发低致敏性产品具有一定的实际意义。

目前，解决鸡蛋过敏问题常采用单一的物理法和化学法，热加工、酶解及高压等是主要的食物脱敏方法。其中，酶解法是最为有效的降低食物致敏性的方法之一，具有条件温和、高效及特异性强等特点。Kasera等采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解3 种豆科植物，结果表明酶水解可有效地降低豆类蛋白质的致敏性，并可用于制备低过敏性食物提取物。王艳等利用不同蛋白酶水解蛋清蛋白，其中碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶水解能有效地降低蛋清蛋白的致敏性。微波是一种新兴的降低食物致敏性技术，其具有高效、节能及操作简便等优势，已被广泛应用于干燥和杀菌等加工领域。近年来，有学者研究利用微波和微波辅助酶水解降低食物致敏性，董晓颖等采用微波处理虾过敏蛋白，通过间接酶联免疫吸附测试（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法测定抗原性变化，结果显示微波处理降低了蛋白致敏性；Izquierdo等采用微波和酶联合处理牛乳清蛋白，结果显示，酶与微波处理相结合能更有效地降低乳清蛋白免疫原性；Ketnawa等研究发现微波处理后的鱼骨蛋白水解产物抗原性均显著降低。综上，微波和酶解处理可改变食物过敏蛋白的免疫原性。目前，国内外对降低蛋白致敏性技术的研究主要集中于单一的处理方式，对复合处理手段的研究相对较少，并且对蛋清蛋白致敏性和结构特性变化关系的研究较少。本团队前期研究采用高压微射流降低蛋清蛋白的致敏性并得到较理想的效果，故在对蛋清蛋白采用单一方法改性的基础上，本研究采用微波、酶解、微波协同酶解处理蛋清蛋白，通过ELISA法对蛋白免疫原性变化进行探究，并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里叶变换红外光谱、内源荧光光谱、外源荧光光谱及紫外光谱等方法对不同处理前后蛋清蛋白样品结构进行表征，从而探究不同处理方法对蛋清蛋白免疫原性及结构性质的影响，为开展后续研究工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜鸡蛋采购于哈尔滨市好又多超市，4 ℃冷藏备用。

碱性蛋白酶（2×10U/g）、菠萝蛋白酶（1.2×10U/g）、木瓜蛋白酶（6×10U/g）、中性蛋白酶（2×10U/g）、胰蛋白酶（250 NFU/mg） 南宁东恒华道生物科技有限责任公司；ELISA试剂盒 美国BioFront Technologies公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、考马斯亮蓝G-250染液等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-1精密增力电动搅拌机 上海浦东物理化学仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；多功能酶标仪 郑州美生商贸有限公司；RF-6000型荧光分光光度计 日本岛津制作所；傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清液的制备及处理

市售的新鲜鸡蛋经清洗后打蛋，分离出蛋清，用镊子挑出系带，用电动搅拌机在300 r/min下搅拌2 h，然后用纱布过滤多余杂质，得到新鲜蛋清液，置于4 ℃贮存备用。

1.3.2 微波处理

将蛋清用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 8.0）进行1∶1稀释，再进行微波处理，当微波功率为700 W时，微波时间分别为10、15、20、30、40 s；当微波时间为30 s时，微波功率分别为70、280、420、560、700 W。

1.3.3 酶解处理

将已处理的蛋清用PBS进行1∶1稀释，分别在各蛋白酶最适反应温度与最适反应pH值（表1）下进行水解。分别加入0.6%（以体系质量计，后同）的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，于水浴振荡器中振荡反应30 min，灭酶10 min；加入碱性蛋白酶，酶添加量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，于水浴振荡器中振荡反应30 min，灭酶10 min。

表1 各蛋白酶的最适反应温度及反应pH值Table 1 Optimum temperature and pH for proteases tested in this study

1.3.4 微波协同酶解处理

选取微波处理700 W/20 s后的蛋清进行酶解处理，分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的碱性蛋白酶，反应30 min，灭酶10 min。

1.3.5 酶联免疫吸附测试

参照聂君等的方法，选用ELISA法分析蛋清蛋白免疫原性。取0.5 mL上述不同条件处理后的蛋清蛋白样品，加入9.5 mL稀释后的ELISA试剂盒抽提缓冲液（使用前预热至60 ℃），在60 ℃下提取10 min。室温下离心10 min，过滤。吸取200 μL样品到96 孔板中孵育10 min，洗涤3 次，每孔中加入100 μL抗体/辣根过氧化物酶底物，孵育后洗涤，最后加入100 μL ELISA试剂盒终止液，在450 nm波长处测其吸光度。具体方法操作参考ELISA试剂盒说明书。根据原始吸光度绘制标准曲线，经软件分析得到未处理蛋清蛋白质量浓度为/（μg/mL），处理后蛋清蛋白质量浓度为/（μg/mL）。按下式计算经不同条件处理后蛋清蛋白免疫原性降低率。

1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，将蛋清蛋白样品用pH 8.0的PBS稀释至1 mg/mL，与上样缓冲液按体积比3∶1混合后加热煮沸5 min，然后1 500 r/min离心3 min。样品上样量为10 μL，先80 V电泳1 h后，将电压调至120 V，直到电泳结束。用考马斯亮蓝G250对凝胶进行染色，然后脱色直到清晰条带出现。拍摄凝胶并观察蛋清体系中蛋白质分子质量的变化。

1.3.7 内源性荧光光谱分析

将蛋清蛋白样品用pH 8.0的PBS稀释至0.1 mg/mL，在激发波长280 nm，发射波长300～420 nm条件下进行光谱扫描，并记录最大发射波长的荧光强度。

1.3.8 紫外光谱分析

将不同条件处理前后的蛋清蛋白样品用pH 8.0的PBS稀释至2 mg/mL，设置扫描波长为240～400 nm，扫描速率100 nm/min，带宽为5.0 nm，间隔为1.0 nm，响应时间为0.2 s，光径为1 cm。重复扫描3 次，累加得到紫外扫描光谱图。

1.3.9 傅里叶变换红外光谱分析

取适量蛋清蛋白样品置于衰减全反射附件上，使用OMNIC软件，在4 000～400 cm范围内进行全波段扫描，扫描分辨率为4 cm，并通过扣除水背景进行基线校准。基于二阶傅里叶变换红外光谱，使用Peakfit 4.12软件定量计算蛋白的二级结构。

1.3.10 外源性荧光光谱

选用荧光探针法测定蛋清蛋白的表面疏水性，用pH 8.0的PBS调整蛋白质量浓度，使其质量浓度梯度为0.25～2.00 mg/mL，取4 mL样液加入20 μL 8 mmol/L的ANS试剂混匀，在室温条件下避光反应15 min，随后设置外源性荧光光谱仪参数：激发波长390 nm、发射波长470 nm、狭缝5 nm，测定样品相对荧光强度，以相对荧光强度为纵坐标、蛋白质量浓度为横坐标作图，以曲线斜率表示样品的表面疏水性（）。

1.4 数据处理与分析

运用Microsoft Excel 2019软件对数据进行统计分析，实验中所有结果均是3 次测定的平均值。采用OriginPro 9.0软件对傅里叶变换红外光谱、紫外光谱、荧光光谱等图谱结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 微波处理对蛋清蛋白免疫原性的影响

由图1可知，与未经微波处理的蛋清蛋白样品比较，微波处理后样品的吸光度均有一定程度的降低，表明微波处理后的蛋清蛋白免疫原性有所降低，且蛋清蛋白样品的免疫原性与微波功率呈负相关，当微波功率达到700 W时，其免疫原性降低最明显，表明在该处理条件下对蛋清蛋白的免疫原性影响最大。究其原因是微波的热效应迫使蛋清蛋白分子发生折叠，隐藏了部分免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G的结合表位，使其免疫原性降低，随着微波功率进一步增加，蛋白分子可能发生了分子内或分子间的聚集，导致部分IgG的结合表位被更多地隐藏或破坏，免疫原性进一步降低。由图2可知，当微波功率一定时，蛋清蛋白免疫原性降低率随着处理时间的延长呈先上升后下降趋势，这可能是随着微波时间的延长，蛋清蛋白空间伸展，暴露出部分表位，但数量远少于被隐藏的表位，所以其免疫原性整体仍呈降低趋势。微波处理条件为700 W/20 s的蛋清蛋白样品免疫原性降低率最高，降低了50.81%。这与陈红兵等的研究结果一致，其研究证实了微波处理可以一定程度降低蛋清蛋白潜在的致敏性，并且所有条件下处理后的蛋清样品结构均发生改变。Lamacchia等的研究也表明小麦籽粒经微波处理后，其抗原性明显降低。

图1 不同微波功率处理对蛋清蛋白免疫原性的影响Fig. 1 Effects of microwave power on immunogenicity of egg white protein

图2 不同微波时间处理对蛋清蛋白免疫原性的影响Fig. 2 Effects of microwave time on immunogenicity of egg white protein

2.2 酶解处理对蛋清蛋白免疫原性的影响

酶水解会降低食物蛋白质的部分过敏原表位数量，从而达到降低其致敏性的效果，其中蛋白酶的添加量和种类等是影响蛋白质致敏性的主要因素。由图3可以看出，不同蛋白酶酶解处理的蛋清蛋白样品免疫原性都有一定程度的降低。其中菠萝蛋白酶酶解后，蛋清蛋白免疫原性残留量最低，最终免疫原性降低了61.22%。其次是碱性蛋白酶，降低了约55.83%。由于每种蛋白酶的作用位点不同，对蛋清过敏蛋白的水解能力不同，因此蛋清蛋白经处理后得到的免疫原性降低率各不相同。王艳等的研究也指出不同酶水解蛋清蛋白后，蛋清蛋白致敏性均降低，其中碱性蛋白酶处理后抗原性降低最明显。实验结果显示采用碱性蛋白酶酶解得到的蛋清蛋白免疫原性降低率仅略低于菠萝蛋白酶，但考虑到蛋清pH值呈碱性，碱性蛋白酶最适pH值为8.0，因此选择碱性蛋白酶进行后续实验。由图4可知，随着碱性蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性呈降低的趋势，当蛋白酶添加量到0.8%及以上时，免疫原性的变化趋于平缓。由于酶解改变了过敏原的构象表位，一般情况下构象表位在水解开始后就会被迅速破坏。而随着酶添加量的增加，蛋白质被水解的程度也逐渐增大，碱性蛋白酶更多地作用在抗原表位上，从而达到降低免疫原性的效果。综上所述，酶水解能有效地降低蛋清蛋白免疫原性，但其免疫原性仍然存在，因此后续的研究可对蛋清样品采用物理法协同酶水解处理，来进一步降低蛋清蛋白的免疫原性。

图3 不同酶种类处理对蛋清蛋白免疫原性的影响Fig. 3 Effects of different proteases on immunogenicity of egg white protein

图4 不同酶添加量处理对蛋清蛋白免疫原性的影响Fig. 4 Effects of enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.3 微波协同酶解处理对蛋清蛋白免疫原性的影响

固定微波条件为700 W/20 s，以碱性蛋白酶添加量为变量进行实验，如图5所示，随着蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性降低率整体呈上升趋势，当蛋白酶的添加量为0.8%时，蛋清蛋白样品的免疫原性下降程度最高，降低了67.48%。与未处理和单独碱性蛋白酶处理的样品相比，通过微波和碱性蛋白酶结合处理所得到的样品免疫原性降低更明显，这是由于微波加快了蛋白酶水解蛋白的速率，微波处理下形成的折叠蛋白可以作为蛋白酶作用的理想底物，使一些表位更容易被酶水解，进而减少部分过敏原表位数量。随着蛋白酶添加量进一步增加，蛋白水解的程度增大，蛋白酶更多地作用在抗原表位上，使免疫原性继续降低。综上，酶解和微波联合处理有助于降低蛋清蛋白的免疫原性，且保留了酶活性和蛋白质结构修饰的可逆热变性，对于降低蛋白质的免疫反应性可能具有实际意义。也有研究报道了与未处理的样品和单独的酶处理样品相比，通过微波与链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶联合处理获得的乳清蛋白水解物免疫反应性显著降低，证明微波辅助酶解处理有助于降低蛋白水解产物的抗原性。

图5 不同微波协同酶解处理对蛋清蛋白免疫原性的影响Fig. 5 Effects of microwave-assisted enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果

卵白蛋白分子质量主要分布在44 kDa处，卵转铁蛋白的分子质量约为76 kDa，卵类黏蛋白的分子质量约为28 kDa，溶菌酶的分子质量约为14.3 kDa。如图6所示，与未处理蛋清蛋白样品相比，微波处理后的蛋清蛋白样品条带灰度轻微变浅，表明蛋清蛋白质量浓度发生了一定程度的降低，这是微波处理使部分蛋清蛋白变性所致，该结果与文献[17]的研究结果一致。从碱性蛋白酶处理蛋清蛋白结果可以看出，目标条带与未处理蛋清蛋白条带相比灰度变得较浅，在14.4～45.0 kDa之间出现一些新条带，说明蛋清蛋白经碱性蛋白酶作用后部分被水解为蛋白片段。而经酶解和微波协同酶解处理的样品在电泳图上呈现出较为一致的结果，卵转铁蛋白条带几乎完全消失，说明卵转铁蛋白不稳定，易发生聚集。与单一酶解处理相比，微波处理下蛋白质降解反应发生得更快。电泳只能从一个侧面反映出过敏蛋白分子的水解效果，并不能反映抗原性的具体变化，因此采用傅里叶红外变换光谱和荧光光谱等对蛋清蛋白的结构变化进一步研究。

图6 不同处理前后蛋清蛋白的SDS-PAGE图Fig. 6 SDS-PAGE patterns of egg white protein subjected to different treatments

2.5 傅里叶变换红外光谱分析结果

通过红外光谱可进一步分析蛋清蛋白质的结构变化规律。红外图谱主要有几组特征吸收谱带，分别为酰胺I带（1 600～1 700 cm）和酰胺II带（1 530～1 550 cm）。其中，酰胺I带主要反映C＝O伸缩振动，最常用于分析蛋白质的二级结构；酰胺II带反映了N—H变形振动或C—N伸缩振动；在3 200～3 400 cm的吸收峰反映了O—H和N—H的伸缩振动。由图7可知，不同方法处理蛋清蛋白的红外光谱都有所差异。4 种样品都在酰胺I带出现了特征吸收现象，而O—H或N—H与C＝O之间形成的氢键比O—H自身形成的氢键所引起的特征现象更明显。未处理的蛋清蛋白在酰胺I带的吸收峰在1 656.26 cm处，经微波和酶解处理的蛋清蛋白分别迁移到1 656.86 cm和1 656.58 cm处，酰胺基谱带的变化说明微波与酶解条件对蛋清蛋白的二级结构造成了影响，其中微波协同酶解处理使-折叠数量减少的程度更大。经过协同处理后，蛋清蛋白的酰胺基吸收峰迁移到1 655.91 cm处，向短波数移动，表明协同处理使N—H与C＝O形成的氢键总量增加。未处理蛋清蛋白的N—H伸缩振动峰在1 541.15 cm处，微波、酶解和微波协同酶解处理后，N—H伸缩振动峰分别迁移至1 540.43、1 540.35 cm和1 541.08 cm，峰强度也有不同程度的增加。这是分子间或分子内的氢键缔合作用产生氢键，使N—H和O—H的键常数减小，相应基团的振动偶极矩变化增大，导致结构的变化。不同处理样品在3 300 cm附近的峰发生了不同程度的迁移，主要是蛋白质分子中N—H伸缩振动与氢键形成了缔合体，蛋清蛋白的二级结构中-螺旋或无规卷曲相对含量提高的缘故。

图7 不同处理条件下蛋清蛋白的红外光谱Fig. 7 Infrared spectra of egg white under different treatment conditions

根据研究报道，蛋白质的二级结构与红外光谱各子峰存在对应关系，即-螺旋结构对应波数范围为1 650～1 659 cm，-折叠结构对应波数范围为1 610～1 639 cm，-转角结构对应波数范围为1 660～1 700 cm，无规卷曲结构对应的波数范围为1 640～1 649 cm，据此计算出的各二级结构相对含量，如表2所示。未处理的蛋清蛋白样品，-螺旋相对含量为22.30%，-折叠相对含量为27.23%，-转角相对含量为28.08%，无规卷曲相对含量为22.40%。与未处理蛋清蛋白相比，700 W微波处理20 s蛋清蛋白样品-螺旋、-折叠和无规卷曲相对含量均有所增加，-转角相对含量降低，表明蛋白质分子间的相互作用会导致蛋白结构的改变，在蛋白质受微波作用变性时，由于疏水残基的暴露导致部分展开分子间相互交联，从而形成-折叠结构。对于酶解和微波协同酶解处理的样品，其蛋白质中各二级结构相对含量均发生变化，-螺旋和无规卷曲结构相对含量均有所增加，而-折叠和-转角结构相对含量相应降低。这是由于酶解与协同处理都使蛋清蛋白二级结构的螺旋结构展开，蛋白分子结构得到伸展，从而导致隐藏在蛋白分子内部的抗原表位暴露在分子表面，进而降低了其免疫原性，这与Golias等研究结果基本一致。综上，不同方法处理蛋清样品吸收峰峰位因处理条件的不同会发生不同程度的变化，蛋清蛋白的二级结构被破坏，蛋白分子中官能团所构成的-螺旋、-折叠和-转角含量也会发生变化，它们之间在不同作用下相互转化或者转化为无规卷曲。

表2 不同处理对蛋清蛋白二级结构相对含量的影响Table 2 Effects of different treatments on the secondary structure content of egg white protein

2.6 内源性荧光光谱分析结果

激发的蛋白内源荧光光谱可以反映是否存在色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸，主要以色氨酸为蛋白质构象变化的反映指标，探究蛋白质三级结构的变化。不同方法改性前后蛋清蛋白样品的内源荧光光谱如图8所示，相比于未处理蛋清蛋白，酶解处理后的蛋清蛋白具有更高的荧光强度，主要是因为在碱性蛋白酶的作用下，掩埋在分子内部的疏水区域被破坏，使色氨酸基团暴露于溶剂中。并且酶解后的蛋清蛋白最大波长发生了轻微的红移，表明蛋白构象被破坏，更多的色氨酸从蛋白质分子内部非极性环境中逐渐暴露出来。酶解改变了蛋清蛋白的三级结构，使过敏原失去原有的活性从而导致蛋白免疫原性降低。微波处理蛋清蛋白样品的内源荧光强度低于未处理样品，是因为蛋白质发生了折叠，部分生色基团被破坏或者掩埋，蛋白因相互聚集掩盖了过敏反应的反应位点，引起免疫原性的改变。微波协同酶解处理样品内源荧光强度高于单一微波处理样品，但低于未处理与单一酶解处理的样品，蛋清蛋白样品并没有发生明显的变化，主要是微波的热效应使蛋白质聚集，酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基被包埋于分子内部，而后随着酶解处理，蛋白质分子先伸展从而暴露出部分生色基团，或者是蛋白质分子之间产生了交联，表面形成了新的生色基团而导致荧光强度的增大，但新形成的生色基团数量远少于最初被包埋的基团，所以总体上生色基团数量仍减少，致使荧光强度低于未处理的样品。微波促进酶水解的同时也加快了过敏原构象表位的变化，使其免疫原性降低更明显。

图8 不同处理前后蛋清蛋白内源性荧光光谱Fig. 8 Fluorescence spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.7 紫外光谱分析结果

蛋白质产生的紫外吸收光谱主要是由色氨酸和酪氨酸残基侧链对紫外光的吸收所形成，氨基酸残基的微环境由蛋白分子的构象决定，一旦蛋白分子的构象改变，所处的微环境发生改变，生色基团的紫外吸收光谱随之发生改变。如图9所示，蛋清蛋白样品经过不同方法处理后，紫外吸光度均发生变化，表明蛋白分子构象发生了变化，抗原的构象表位遭到破坏，故蛋白的免疫原性降低。相比于未处理的蛋清蛋白样品，微波处理蛋清蛋白样品的紫外吸光度降低，这是由于蛋白分子发生聚集，芳香族氨基酸残基被掩藏于蛋白分子内部，不能发挥其显色作用。经酶解及微波协同酶解处理样品的吸光度较未处理样品均出现一定程度的增加，表明酶解使蛋白质的空间结构展开，色氨酸和酪氨酸残基暴露于分子表面，导致其紫外吸光度升高。复合处理的样品先是在微波条件下蛋白质分子发生聚集，随着酶解的进行，蛋白结构展开，疏水基团暴露出来，使其紫外吸光度升高，总体芳香族氨基酸残基暴露量低于单一酶解改性样品，故紫外吸光度低于酶水解处理的样品。Ai Minmin等研究采用不同蛋白酶水解皮蛋清凝胶，结果表明蛋清酶解产物的紫外吸光度均发生了不同程度的增加，说明酶水解改变了蛋白结构。

图9 不同处理条件下蛋清蛋白紫外吸收光谱Fig. 9 UV absorption spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.8 表面疏水性分析结果

疏水相互作用是维持蛋白质三级结构的主要作用力，ANS与蛋白质结合的荧光强度与蛋白的表面疏水性呈正相关，利用外源性荧光光谱对不同方法处理蛋清蛋白样品的疏水性进行分析，如图10所示，酶解、微波和微波协同酶解处理蛋清蛋白样品的表面疏水性均比未处理样品高，且经过微波协同酶解处理的样品表面疏水性最高，这可能是碱性蛋白酶的作用使包埋在蛋白内部的疏水基团暴露，从而导致表面疏水性的增加。也可能是水解使蛋白结构部分展开，导致掩埋在蛋白质中的疏水位点暴露。微波700 W处理20 s的蛋清蛋白样品由于蛋白质分子相互作用，从而使蛋白质内部疏水基团暴露在表面，增加了与ANS的结合位点数量。在此过程中，蛋清蛋白的抗原表位由此被破坏或在聚合变性时被隐藏，从而不能与结合位点结合，使其免疫原性降低。复合处理后蛋清蛋白的表面疏水性最高，微波破坏了蛋白质的空间结构，进而促使蛋白酶更容易作用于蛋白质，导致其表面疏水性增加，免疫原性进一步降低，这与常慧敏的研究结果一致。郭荣佳利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白，结果表明酶解处理大豆分离蛋白表面疏水性整体均高于未处理大豆分离蛋白。Zang Xiaodan等研究发现经胰蛋白酶水解后米糠蛋白疏水性增加，这归因于蛋白质结构的展开和疏水基团的暴露。

图10 不同处理条件下蛋清蛋白的表面疏水性Fig. 10 Surface hydrophobicity of egg white protein under different treatment conditions

3 结 论

微波、酶解和微波协同酶解处理对蛋清蛋白免疫原性均有不同程度的影响。微波处理可降低蛋清蛋白免疫原性，当微波700 W处理20 s时，蛋白免疫原性降低率最高（50.81%）。此条件下蛋白质分子发生聚集，部分生色基团和芳香族氨基酸残基被包埋，分子相互作用使内部疏水基团暴露，一定程度修饰了过敏表位，导致免疫原性降低。不同蛋白酶水解后，蛋清蛋白免疫原性均降低，其中碱性蛋白酶水解后免疫原性降低了55.83%。随着酶添加量的增加，其免疫原性降低率逐渐增加。酶水解使蛋清蛋白分子空间结构展开，疏水基团和芳香族残基暴露，改变了蛋白的三级结构，使高级结构中的化学键断裂，过敏原失去活性引起免疫原性的降低。经微波协同酶解处理后，蛋清蛋白的免疫原性随着酶添加量的增加进一步下降。经协同处理后的SDS-PAGE条带发生变化，-螺旋结构相对含量有所增加，而-折叠结构相对含量相应降低，疏水基团逐渐暴露，说明微波协同酶解处理导致蛋清蛋白的二、三级结构发生改变，据此可知，蛋清蛋白的免疫原性随着其构象的改变而改变，通过破坏蛋白的构象及抗原表位能够使其免疫原性降低。综上所述，微波和酶解处理对降低蛋清蛋白免疫原性具有协同作用，但蛋清蛋白结构与免疫原性变化的具体原因还有待进一步研究。