乳酸克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

刘士琦，荣兰新，赵栢祥，卢志慧，赵 禹，肖冬光，于爱群,2,*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457）

合成生物学是一门综合了生物学、化学、物理学和工程学等学科知识的新兴前沿交叉学科。近年来，合成生物学理论和技术的迅猛发展也对生命科学基础研究和工业生物技术产生了深远影响，尤其是在构建微生物细胞工厂生物合成生物燃料、平台化学品、复杂大分子等各种高附加值产品方面展现出了巨大的应用前景和赋能潜力。合成生物学的发展正在为医药、化工、食品、能源、材料、农业等各个工业领域带来深刻变革，也必定对人类社会发展产生广泛和深刻的影响。其中，酵母菌属于单细胞低等真核生物，它兼有原核生物和真核生物两者的优点，因此被认为是合成生物学研究最理想的模式生物之一。

乳酸克鲁维酵母最早是从牛奶中分离得到的一种非常规酵母菌。对该酵母的遗传学研究开始于20世纪60年代初，起初其被归为酵母属，被命名为。但后来发现该酵母不能与酿酒酵母（）进行杂交，又将其归为克鲁维酵母属；再后来其又被更名为马克思克鲁维酵母乳酸变种（var.）。直到20世纪90年代，以分子生物学为基础的分类方法确定了该酵母与马克思克鲁维酵母实际上是两个独立的物种，并最终将其命名为乳酸克鲁维酵母（）。

乳酸克鲁维酵母细胞呈球形或椭圆形，细胞体积略小于酿酒酵母细胞，主要进行多边芽殖，不产生子囊孢子和假菌丝；菌落呈乳白色，表面光滑、隆起，边缘整齐，无褶皱，略有光泽，质地细腻有黏性。与酿酒酵母不同，乳酸克鲁维酵母属于严格好氧菌，其可利用的碳源范围也更为广泛，包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、乙醇、甘露醇、乳酸、琥珀酸、柠檬酸等，特别是由于其能够产生-半乳糖苷酶和乳糖透性酶分解乳糖，因此，能够在以乳糖为唯一碳源的培养基中生长。乳酸克鲁维酵母与酿酒酵母之间既有相似之处，又有不同之处。表1主要从传代方式及能量代谢等方面比较了这两种酵母的异同，其中这两者较为明显的差异是酿酒酵母在有氧条件下也会受到克雷布特效应的影响，而乳酸克鲁维酵母不存在该效应，因而在发酵过程中更易获得较高的菌体生物量。此外，乳酸克鲁维酵母底盘细胞作为异源表达宿主还具有诸多优势：第一，它已被美国食品药品监督管理局认证为食品安全级（generally recognized as safe，GRAS）微生物；第二，其遗传背景清晰，易于进行遗传操作，且基因游离表达和整合表达的稳定性均较高；第三，其蛋白分泌能力强、糖基化适度；第四，其可以在标准酵母培养基中生长，大规模发酵时不需要甲基营养型酵母（例如巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母）所需的防爆发酵设备。自20世纪50年代以来，乳酸克鲁维酵母一直被用作-半乳糖苷酶（俗称乳糖酶，可降解乳糖，是无乳糖乳制品生产所必需的酶）的工业生产菌株。从20世纪60年代开始，干燥失活的乳酸克鲁维酵母一直被用作食品补充剂。因此乳酸克鲁维酵母在食品发酵工业中具有重要的研究意义和广阔的应用前景。

表1 乳酸克鲁维酵母与酿酒酵母主要特征的对比Table 1 Comparison of key features of K. lactis with those of the model yeast S. cerevisiae

近年来，以乳酸克鲁维酵母为底盘细胞开展的一系列合成生物学方面的基础及应用研究发展迅速，并逐渐成为研究热点。本文主要对乳酸克鲁维酵母底盘细胞在合成生物学元件、遗传操作工具、基因编辑策略等方面的研究进展进行了介绍，并对利用合成生物学手段构建乳酸克鲁维酵母细胞工厂的应用研究进展进行了综述和展望。

1 乳酸克鲁维酵母的分子遗传学及合成生物学研究进展

1.1 合成生物学元件

以已知的代谢网络和重组DNA技术为基础，采用自下而上的理念，通过设计一些合成生物学功能元件以精确调控代谢途径，改善微生物底盘细胞性能，从而实现目的产物的高效合成是合成生物学的重要研究内容之一。近年来，研究人员已经在乳酸克鲁维酵母底盘中构建了能够稳定表达的载体（整合型质粒和游离型质粒），并对启动子、终止子和信号序列等常用（合成）生物学功能元件进行了优化，从而大大提升了乳酸克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的潜力。本节主要总结乳酸克鲁维酵母底盘中常用的合成生物学元件以及分子遗传学方面的研究进展。

1.1.1 启动子

通过控制启动子的强度可以有效改变基因表达水平。高效的强启动子通常会对外源基因表达产生很强的促进作用，因此构建和筛选强启动子是提高乳酸克鲁维酵母底盘中外源产物产量和得率的有效策略。

目前，虽然有一些乳酸克鲁维酵母的组成型和诱导型启动子已经得到了功能鉴定，但总地来说，已报道的可用于异源基因表达的高效启动子数目仍然较少。其中，-半乳糖苷酶基因（）的启动子P是目前在乳酸克鲁维酵母底盘中应用最广泛的内源强启动子，该启动子可由乳糖或半乳糖诱导（图1）。在乳酸克鲁维酵母细胞内，转录激活因子Lac9对P具有激活作用，而Lac9又受到抑制剂KlGal80和双功能蛋白KlGal1的调控。当细胞内乳糖水解或吸收胞外半乳糖时，KlGal1开始发挥作用，催化半乳糖转化为半乳糖-1-磷酸；同时KlGal1与KlGal80结合并使其失活，从而进一步诱导Lac9的表达，最终实现了对基因的诱导表达。

图1 乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶基因启动子PKlLAC4的转录调控机制Fig. 1 Mechanism for the transcriptional regulation of the promoter of the β-galactosidase gene in K. lactis

此外，在乳酸克鲁维酵母底盘中应用较多的其他一些启动子还包括来自酿酒酵母的组成型启动子P，乳酸克鲁维酵母内源诱导型启动子P、P和P等。P是酿酒酵母中磷酸甘油酸激酶基因（）的启动子，也是酿酒酵母中具有较高活性的启动子之一，目前已被成功应用于乳酸克鲁维酵母生产白细胞介素-1β和嗜热酯酶等。P是乳酸克鲁维酵母酸性磷酸酯酶基因（）的启动子，它受到胞内无机磷酸盐浓度的调节；磷酸盐浓度低对乳酸克鲁维酵母酸性磷酸酯酶的合成具有较明显的促进作用，目前该启动子也已被应用于乳酸克鲁维酵母生产白细胞介素-1β和-淀粉酶。编码乳酸克鲁维酵母线粒体乙醇脱氢酶基因（）的启动子P是乙醇诱导型启动子，且该启动子并不受葡萄糖的抑制，已被用于人血清白蛋白、--阿拉伯呋喃糖苷酶和超氧化物歧化酶等多种蛋白在乳酸克鲁维酵母底盘中的生产。P是乳酸克鲁维酵母中编码丙酮酸脱羧酶基因（）的启动子，其活性受到碳源和溶氧水平的调控，已被用于乳酸克鲁维酵母异源生产来自毛栓菌（）的漆酶和来自一种耐盐酵母菌（）的葡萄糖淀粉酶等。天然启动子的使用大大提高了蛋白及其他高值产物的表达水平，除了这些天然存在的内源和外源启动子，人工合成启动子也已被证明是微生物细胞工厂中非常具有发展潜力的合成生物学元件之一。例如，Sakhtah等通过将组成型启动子P和碳源敏感型启动子P的部分区域在体外进行杂合，构建出了受碳源精确调控的人工杂合启动子P，当培养基中存在葡萄糖和甘油等碳源时，该启动子的功能被抑制；当培养基中的碳源被耗尽时，该启动子就被激活并启动目的基因的表达。该研究构建的受碳源精确调控的人工启动子对于进一步阐明酵母启动子的作用机制具有十分重要的意义。随着酿酒酵母和解脂耶氏酵母等酵母人工合成启动子研究的不断深入，势必会促进乳酸克鲁维酵母人工合成启动子的快速发展。

乳酸克鲁维酵母底盘中异源表达目标基因中常用的启动子如表2所示。

表2 乳酸克鲁维酵母底盘中异源表达目标基因中常用的启动子Table 2 Most commonly used promoters for heterologous expression of target genes in K. lactis

1.1.2 终止子

相比于启动子，终止子对于基因转录水平和mRNA稳定性的影响经常被低估。但实际上，在酵母菌等真核生物中，终止子既能够在转录水平上调控基因的表达，又能够影响转录后mRNA的稳定性，因此它也是非常重要的合成生物学元件。

在酿酒酵母中，最常用的终止子包括t和t，但这两个终止子的序列较长，不利于多基因表达载体的构建。为了解决这一问题，Curran等开始构建一系列短的、人工合成的终止子，相比于酿酒酵母的t，这些人工终止子中蛋白荧光强度和mRNA表达量最高分别增加了3.7 倍和4.4 倍；此外，Curran等还将基于酿酒酵母的人工合成终止子在解脂耶氏酵母中进行了功能验证，结果发现该合成终止子有很好的种间可转移性。乳酸克鲁维酵母表达系统经常使用的终止子是其内源的t和来自酿酒酵母的终止子如t、t和t等。然而到目前为止，还没有关于乳酸克鲁维酵母人工终止子基因工程的报道，在酿酒酵母底盘中得到功能验证的人工合成终止子也并未在乳酸克鲁维酵母底盘中得到应用，但是在酿酒酵母和解脂耶氏酵母中可以进行功能转移人工合成终止子的研究为异源合成终止子在乳酸克鲁维酵母中的应用开拓了思路。因此，利用合成生物学技术来开发乳酸克鲁维酵母适用的性能稳定、功能可控的人工合成终止子可以成为未来乳酸克鲁维酵母分子遗传学和合成生物学研究的重点分支方向之一。

1.1.3 信号序列

信号序列是一段疏水氨基末端的延伸，具有引导多肽链进入内质网腔的功能，也是酵母底盘中调控基因表达和蛋白质分泌所必不可少的生物学元件。通常情况下，蛋白质在细胞质中的积累量远远大于其在培养基中的积累量，这使得下游加工过程中需要额外引入复杂的蛋白质纯化工艺。相对而言，胞外分泌的蛋白质纯化过程会更简单、高效，更利于大规模工业化生产。因此，合适信号序列的选择是酵母底盘细胞高效合成内源/外源蛋白质的重要环节。酵母细胞中负责分泌特定蛋白的信号序列通常包含一个位于信号序列和异源蛋白之间的C末端Kex2蛋白酶识别位点，因此，一旦新产生的多肽进入内质网，信号序列就被切除。真核生物信号序列之间的保守性非常强，而且一般情况下，天然存在的信号序列就能够满足对外源蛋白进行有效分泌的要求。

到目前为止，一些内源、外源和合成的信号序列已经被成功应用到乳酸克鲁维酵母表达系统中以合成各种具有不同分泌需求的外源蛋白质。比如，Fleer和Berg等分别以人血清白蛋白和凝乳酶为模型蛋白，比较了乳酸克鲁维酵母中不同分泌信号的作用效果。Madhavan等将里氏木霉（）的外切纤维素酶I基因（）的分泌信号与P启动子融合，在乳酸克鲁维酵母中进行重组蛋白的表达，并与来自酿酒酵母的-交配因子（-mating factor，-MF）信号肽进行功能比较，结果表明分泌信号更能显著提高重组蛋白在乳酸克鲁维酵母底盘中的表达量。上述研究结果表明不同的分泌信号对蛋白的胞外分泌影响十分明显，因此需要开发具有普适性、效率高的分泌信号序列，为异源蛋白的高效表达提供稳定可靠的解决方案。

1.1.4 选择标记

目前，在乳酸克鲁维酵母遗传操作系统中，通常是选择营养缺陷型和药物抗性来作为筛选标记。其中，抗性标记能够在包括原养型菌株在内的任何菌株中使用，而G418和博来霉素这两种真菌抗生素的应用更为广泛。营养缺陷型标记只能应用于特定的菌株，而、、也已经被证明是筛选乳酸克鲁维酵母阳性转化子的理想标记。此外，氮源筛选标记的利用也是在乳酸克鲁维酵母中重要的特异性筛选方案。该筛选标记是以构巢曲霉（）中的乙酰胺酶（由基因编码）为基础形成的，乙酰胺酶可以将乙酰胺分解生成含氮化合物，供菌株生长。当其作为筛选标记时，乙酰胺就是培养基中的唯一氮源，只有成功转化含有乙酰胺酶标记的阳性菌株才能在该筛选培养基上生长。该方案已经被应用于乳酸克鲁维酵母商用菌株GG799中，并成功实现了对牛肠激酶、纤维素酶等多种蛋白的异源表达。乙酰胺酶还可以分解氟乙酰胺，生成对细胞有毒害作用的物质，使含有乙酰胺酶标记的菌株不能生长，因此利用这一原理还可以实现该筛选标记的回收和重复利用。

1.1.5 质粒载体

外源基因在酵母中的表达主要有两种策略：游离型质粒表达和整合型质粒表达。游离型质粒基因具有拷贝数较高的优点，但是在没有选择标记的情况下容易发生丢失；整合型质粒具有能够在细胞中较稳定表达的优点，但基因拷贝数通常较低。

目前，最常用的乳酸克鲁维酵母整合型质粒是由美国NEB公司生产的商用载体pKLAC1和pKLAC2，该系列载体含有突变的Pribnow序列（PBI）、乳酸克鲁维酵母内源基因终止子t、由酿酒酵母启动子P调控的黑曲霉乙酰胺酶基因（）的选择标记基因、氨苄西林抗性基因（）和大肠杆菌复制起点（ori）。

目前在乳酸克鲁维酵母中可用的游离型质粒大多是以天然质粒为基础构建形成的。其中，从果蝇克鲁维酵母变种中分离得到的pKD1质粒在乳酸克鲁维酵母中的应用较为广泛。该质粒的特征与酿酒酵母的2 μm质粒较为相似，包含一个果蝇克鲁维酵母的复制起点、编码位点特异性质粒重组酶的基因A、参与分配的基因B和C、顺式作用分配位点和反向重复序列的重组酶位点。

嗜杀质粒pGKLl和pGKL2是一种线性双链DNA质粒，天然存在于多个克鲁维酵母菌株中。它们能够在细胞质中稳定存在，且拷贝数较高（每个细胞中可达100～200 个拷贝），也能够产生异源三聚体内毒素。嗜杀质粒作为乳酸克鲁维酵母的表达载体时存在两个明显缺陷：第一，嗜杀质粒的5′端通常含有共价连接蛋白，这使得体外操作更加复杂，并阻碍了其在大肠杆菌中的扩增；第二，嗜杀质粒中目的基因的表达通常需要特定的转录信号，Kamper等通过将外源基因与pGKL1中ORF2的启动子和终止子融合构建表达盒的方法较为理想地解决了该问题。

1.2 基因编辑策略

在代谢工程和合成生物学改造过程中，通常会涉及到多基因的遗传修饰。因此，高效的基因编辑技术是代谢工程和合成生物学的基本工具。随着各种高效、精准的基因编辑技术在乳酸克鲁维酵母底盘中的成功应用，极大推动了关于乳酸克鲁维酵母代谢工程和合成生物学研究的快速发展。本节对传统的基因定点靶向整合技术以及应用前景较好的CRISPR-Cas技术在乳酸克鲁维酵母底盘中的应用情况进行综述。

1.2.1 基因定点靶向整合技术

外源DNA片段整合到微生物底盘细胞的基因组中需要借助其双链断裂（double strand break，DSB）修复机制。目前，在真核细胞中主要有同源重组和非同源末端连接两种修复机制。同源重组整合外源基因主要依赖于基因簇，包括、、、、和等基因，可以实现外源基因在底盘细胞基因组的精确定点整合；而介导非同源末端连接的基因主要包括、、（哺乳动物中）、和等，这可能会造成异源基因的表达盒或线性化质粒随机连接到底盘细胞基因组的不同位置上。在酿酒酵母细胞中，外源基因的整合更偏向于利用同源重组的修复方式，而乳酸克鲁维酵母的DNA修复偏好性则与酿酒酵母完全不同，非同源末端连接是外源DNA整合到其基因组上的最常见方式。例如，在野生型乳酸克鲁维酵母中，外源基因的同源臂长度为50 bp时的整合效率为0%，当同源臂长度增加到600 bp时，整合效率提高到88%；但是，构建过长同源臂往往费时费力，为了实现乳酸克鲁维酵母细胞工厂的快速构建，敲除介导异源基因非同源末端连接的基因可以提高乳酸克鲁维酵母异源基因定点整合的效率。目前，乳酸克鲁维酵母基因组中常用的定点整合位点是位点，NEB公司针对该位点设计了经典的整合型质粒pKLAC1和pKLAC2，并一直沿用至今。使用该系列质粒时，应首先利用限制性内切酶II对该质粒进行线性化，随后P启动子的5’端和3’端可分别作为上下游同源臂与乳酸克鲁维酵母基因组上的位点进行同源重组，从而实现外源基因在乳酸克鲁维酵母基因组上的高效定点靶向整合。具体过程如图2所示。

图2 通过同源重组机制将外源基因表达盒整合到乳酸克鲁维酵母基因组LAC4位点的示意图Fig. 2 Strategy for integrating heterologous gene expression cassettes into the LAC4 locus of K. Lactis via homologous recombination

1.2.2 CRISPR-Cas技术

2003年，Mojica等发现来自细菌的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）与部分病毒序列相匹配，并推测CRISPR是细菌免疫系统的一部分。随后，多项研究进一步揭示了CRISPR的功能。如今，CRISPR基因编辑技术发展十分迅速，该技术具有操作简便、重组效率高、实验成本低等诸多优点，极大地提高了对各类细胞基因组的编辑效率，并且已经在包括乳酸克鲁维酵母在内的许多生物体中得到了成功应用。由于传统方案需要利用多个筛选标记来进行异源基因整合阳性转化子的筛选，因此分子操作更加复杂，耗时更长；而CRISPR-Cas系统工作时，sgRNA首先定位到基因组上的目标位点，随后引导Cas9蛋白对目的基因进行切割，以实现目的基因的精准编辑，因此操作十分简便高效。Horwitz等在乳酸克鲁维酵母中利用CRISPR-Cas技术将6 个外源基因同时整合到基因组的3 个靶向位点上，快速构建了粘康酸的异源合成通路；Burghardt等利用CRISPR-Cas9系统将乳酸克鲁维酵母的内源果糖转化酶基因敲除以后，将合成低聚果糖的果糖转移酶活性提高了66.9%。经过对CRISPR-Cas系统的不断探索，研究人员已经实现了对乳酸克鲁维酵母工程菌株基因组的高效编辑，与传统的基因组编辑策略相比，CRISPR-Cas可以实现同时对多个基因的编辑。但目前CRISPR-Cas系统在乳酸克鲁维酵母中的应用仍有一些不足之处，如CRISPR-Cas技术对目的基因的识别依赖于前间隔片段临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列（NGG），因而存在一定的局限性。Harrington等研究发现Cas14蛋白在识别目的基因时不依赖于PAM序列，因此有望解决这个问题。此外，sgRNA对于Cas蛋白与目标序列的结合有至关重要的作用，不同的sgRNA特异性和稳定性在微生物底盘中的差异巨大，且容易造成脱靶和效率低等问题。为了解决这一问题，Guo Jiahui等在大肠杆菌中通过对约70 000 个sgRNA的活性及效率等指标进行分析，建立了一个较为全面的sgRNA图谱，可以针对该模式微生物基因组上的任何位点选择具有高度活性的sgRNA，有助于提高sgRNA的特异性及解决脱靶问题。总之，虽然CRISPR-Cas技术已成功用于对乳酸克鲁维酵母基因组的编辑，但该技术尚未在乳酸克鲁维酵母中得到广泛应用，因此也展现出相当大的应用潜力和发展空间。随着对CRISPR-Cas系统的不断优化，在乳酸克鲁维酵母底盘细胞中进行代谢网络的重构将变得更加快捷和高效。

1.3 常用宿主菌

和酿酒酵母相同，乳酸克鲁维酵母也是雌雄异体菌株，有两种交配类型：a和α。目前常用的乳酸克鲁维酵母菌株主要有NRRL Y-1140（CBS 2359、ATCC 8585）、NRRL Y-I118（CBS 6315、ATCC 8563）和NRRL Y-1205（CBS 2360、ATCC 8651）。其中，NRRL Y-1140是应用最广泛的菌株，酵母中常用的嗜杀质粒pGKLl和pGKL2也是在该菌株中被首次发现。NRRL Y-1205是一种自然变异菌株，细胞内含有一个隐性的等位基因，在正常培养条件下，该菌株没有明显的生长缺陷；但是当细胞呼吸功能被线粒体抑制剂阻断时，该菌株就不能在含有葡萄糖的培养基上正常生长。研究证明，在其他乳酸克鲁维酵母菌株如CBS 141、CBS 5618和CBS 8043中也具有类似功能的等位基因。表3列出了目前分子遗传学和合成生物学研究中应用最为广泛的乳酸克鲁维酵母宿主/底盘菌株。

表3 常用的乳酸克鲁维酵母宿主菌株Table 3 Most commonly used host strains of K. lactis

2 利用合成生物学技术改造乳酸克鲁维酵母生产高值产品的应用实例

乳酸克鲁维酵母具有外源蛋白表达量高的明显优势，因此是外源基因/生物合成途径表达的优良宿主/底盘细胞。在过去30 年里，已有上百种重组蛋白在乳酸克鲁维酵母底盘中实现了异源表达，并有多种蛋白已经实现了工业化生产。本节对近年来以乳酸克鲁维酵母底盘细胞所构建的细胞工厂生产蛋白质和其他高附加值产品的实例进行总结。

2.1 已工业化生产的蛋白质产品

荷兰帝斯曼公司利用乳酸克鲁维酵母作为细胞工厂已经成功实现了多种胞内蛋白和外泌蛋白的工业化生产。例如，乳酸克鲁维酵母产生的蛋白酶能分解乳糖，因此可以用于乳产品的生产；乳酸克鲁维酵母产生的-半乳糖苷酶主要用于生产不含乳糖的乳制品和益生元低聚半乳糖，乳酸克鲁维酵母生产的-半乳糖苷酶已经在各大公司得到大规模生产并分别被命名为Maxilact（荷兰帝斯曼公司）、Lactase（意大利SNAM Progetti公司）、Biolactase（荷兰Quest International公司）和-Galactosidase（美国Sigma-Aldrich公司）等上市。

2.2 乳酸克鲁维酵母在制药产业的应用潜力

到目前为止，乳酸克鲁维酵母已被证明是大规模生产药物及其中间体的优良底盘细胞，因此在制药产业中展现出非常大的应用潜力。例如，干扰素β是一种与细胞抵抗病毒和调节免疫反应有关的细胞因子，是一种治疗多发性硬化症的有效药物。Madhavan等将来自人的干扰素β基因与葡萄糖淀粉酶信号序列融合，克隆到pKLAC1载体中后再导入乳酸克鲁维酵母基因组中进行生产，并通过对HeLa细胞进行抗增殖实验验证了其生物活性；巨噬细胞刺激因子是一种用于治疗造血系统疾病的药用蛋白，Hua Zhongsheng等在乳酸克鲁维酵母中表达了人属巨噬细胞刺激因子cDNA的截短片段，并成功纯化出了具有活性的蛋白。此外，乳酸克鲁维酵母还被用于生产治疗糖尿病的胰岛素前体、-乳球蛋白、白细胞介素1β、人血清白蛋白和其他各种抗体。乳酸克鲁维酵母成功表达异源药用蛋白大大促进了制药产业向新方向发展，必将成为药用蛋白的优秀生产菌株。

2.3 其他高值产品的生产

乳酸克鲁维酵母除了以上在蛋白生产中的应用以外，其在其他高值产物的生产上同样具有广阔的应用前景。例如，-乳酸是被用于生产可降解聚合材料的平台化学品，Porro等在乳酸克鲁维酵母基因组中引入了来自牛的乳酸脱氢酶基因，同时敲除了内源的丙酮酸脱羧酶基因，使工程菌株成功发酵产生了高纯度的乳酸，通过生物反应器放大培养，工程菌株中乳酸的终产量达到了109 g/L。与酿酒酵母相比，丙酮酸脱羧酶基因的敲除对乳酸克鲁维酵母的生长没有明显的影响，因此利用该优势，通过乳酸生成途径代替乙醇生成途径，既成功生产出乳酸，又降低了乙醇产生对乳酸纯度的影响；同时也从侧面证明了该酵母对低pH值条件有较强的适应性，在低pH值的高值产品生产方面也有很大的潜力。乙醇酸是一种优良的可降解生物材料，Koivistoinen等利用代谢工程及合成生物学技术对乳酸克鲁维酵母进行改造，先引入乙醛酸还原酶，成功实现了乙醇酸在乳酸克鲁维酵母中的生产，随后敲除了内源的苹果酸合酶和异柠檬酸脱氢酶基因来改造该酵母的乙醛酸循环途径，最终将目标产物产量提高至2 g/L，然后通过生物反应器扩大培养，最终使乳酸克鲁维酵母中乙醇酸的产量达到了15 g/L。该研究也对酿酒酵母进行了同样的代谢改造，然而乳酸克鲁维酵母工程菌株乙醇酸的产量却远高于酿酒酵母（0.9 g/L），这可能也与乳酸克鲁维酵母对低pH值有较强的适应性有关。-抗坏血酸在植物中通常由葡萄糖经10 步反应生成，Rosa等利用代谢工程及合成生物学技术成功构建了能够生产-抗坏血酸的乳酸克鲁维酵母工程菌，首先通过引入来自黑曲霉的鸟苷二磷酸-甘露糖-3,5-异构酶、鸟苷二磷酸--半乳糖-磷酸化酶和-半乳糖-1-磷酸盐磷酸化酶3 种途径酶，成功将-半乳糖转化为-抗坏血酸，工程菌株中-抗坏血酸的终产量达到了30 mg/L。此外，研究人员也开发了可以将低值底物转化为高值产品的乳酸克鲁维酵母细胞工厂，如将-木糖作为底物来生产-木糖酸，利用乳糖为底物生产阿拉伯糖醇等。

乳酸克鲁维酵母底盘生产高值产品的部分代表性实例如表4所示。

表4 乳酸克鲁维酵母底盘生产高值产品的部分代表性实例Table 4 Representative examples of high-value products produced by engineered K. lactis

3 结 语

随着合成生物学的快速发展，微生物细胞工厂的深入探索与应用必将成为生物制造的新趋势。乳酸克鲁维酵母是一种十分重要的非常规酵母，其在形态特征、生理特性以及遗传代谢等方面与常规酵母——酿酒酵母均有较大差异，其中最明显的区别是乳酸克鲁维酵母可以利用廉价的乳清作为唯一碳源进行生长。此外，乳酸克鲁维酵母并不受克雷布特效应的影响，所以非常适合大规模的发酵生产。因此，该酵母在微生物基础研究和应用研究方面都具有非常大的发展潜力。

本文主要对目前乳酸克鲁维酵母中常用的合成生物学元件（启动子、终止子、信号序列、选择标记和质粒载体等）、最新的基因编辑策略以及以乳酸克鲁维酵母为底盘细胞生产高值产品的应用实例进行了系统总结。今后最需要关注的热点问题包括以下几点：第一，启动子和终止子是目前控制基因表达最重要、最有效的功能元件。乳酸克鲁维酵母中目前最常用的启动子和终止子分别是内源的-半乳糖苷酶基因启动子P和终止子t，而关于人工启动子和终止子在乳酸克鲁维酵母底盘中的理论及应用研究还十分缺乏。因此，要实现外源基因/产物的稳定高效表达，人工启动子和终止子工程的联合开发与应用可能是将来的研究重点。第二，随着先进基因编辑技术如CRISPR-Cas在乳酸克鲁维酵母底盘中的快速发展及应用，未来乳酸克鲁维酵母工程菌株的开发速度将大大提高。要真正实现乳酸克鲁维酵母细胞工厂的快速构建，解决CRISPR-Cas系统对PAM序列的依赖性和脱靶问题仍是将来的研究重心。第三，目前乳酸克鲁维酵母细胞工厂的最主要应用仍然集中在工业蛋白的生产上，但是利用其生产大宗化学品、精细化学品和天然产物等高值产物的研究仍然较少。随着乳酸克鲁维酵母合成生物学元件的不断开发和基因编辑策略的不断优化，一定会有更多高附加值产品在乳酸克鲁维酵母底盘中实现高效生产。此外，实验室适应性进化是一种较为有效的优良菌株构建策略，利用实验室适应性进化技术与理性的合成生物学设计相结合，在基因组水平进行多位点同时编辑或连续进化已被证明具有可行性。由于乳酸克鲁维酵母底盘天然具有的转化廉价碳源底物的能力，该方案势必会极大地推动绿色清洁、可持续发展的乳酸克鲁维酵母细胞工厂的构建；该酵母也势必将成为未来工业生物技术发展中优良的工业微生物细胞工厂。