苦瓜醋的体外抗氧化及胆酸盐结合能力研究

朱玉娇，原 媛，王佳琪，张存莉，2

（1.西北农林科技大学 化学与药学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西五丁生物科技有限公司 汉中市食用植物酵素研发与监测重点实验室，陕西 汉中 724400）

苦瓜（Momordica charantia）又称凉瓜、癞葡萄、锦荔枝，属于葫芦科草本植物[1-2]。苦瓜作为一种药食同源品，营养丰富，除了含有碳水化合物、蛋白质、矿物质和维生素[3-4]外，还有一些特殊的化学成分，如苦瓜多糖、苦瓜皂苷、苦瓜蛋白、胰岛素多肽、类黄酮化合物、生物碱等功能性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗菌、增强免疫力等生物活性功能[5-7]，是公认的功能保健品，受到消费者的青睐。

食醋是经酵母菌、醋酸菌发酵制得的一种酸性调味品，除了含有乙酸、丙酸等短链脂肪酸以及苹果酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸等有机酸，还含有氨基酸、维生素、无机盐等营养成分。此外，食醋还具有多种保健功能，如软化血管、促进消化、解酒护肝、抗氧化、抗菌、降胆固醇、降糖等，在现代社会得到广泛的应用[8-10]。目前，已开发出多种醋饮料，如苹果醋、山楂醋、茶醋、枣醋、燕麦醋、苦荞醋等，成为一种新兴的集风味与营养并存的保健饮品。卜智斌等[11]利用醋酸杆菌（Acetobacter aceti）发酵骏枣果酒制备骏枣果醋，发现其发酵后乙酸和琥珀酸含量显著增加，乳酸、草酸及总酚含量显著降低，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和总抗氧化能力显著升高。刘杰超等[12]利用巴氏醋酸杆菌半液态深层发酵红枣酒制备红枣醋，结果发现发酵后总酚和总黄酮含量以及DPPH和2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+）自由基清除能力、Fe3+还原能力分别提高16.59%、42.98%、24.66%、38.07%和27.87%。赵鑫等[13]研究发现桑葚经酵母菌和醋酸菌发酵后对羟基自由基和DPPH自由基具有较好的清除能力，清除率分别达到92.63%和94.48%。陈树俊等[14]采用传统制醋工艺制备苦荞功能醋粉，研究发现其可显著降低大鼠血压和有效缓解大鼠体质量、心率、肝质量的非正常增长以及肝脏的过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）的非正常变化，并能够显著稳定大鼠血清一氧化氮（NO）、内皮素（endothelin，ET）-1及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的含量。

然而，单纯的醋制品还存在嗅味刺激性大、回味不长久及调味差等问题。研究表明，在食醋酵母菌发酵阶段加入乳酸菌，可发酵产生乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，其可与酵母菌代谢产生的乙醇合成酯类物质，起到缓和酸味，增加酯香气味，使食醋口感柔和、醋味绵长的作用。此外，乳酸菌发酵产生的蛋白酶等，可分解蛋白产生氨基酸和短肽，使食醋口感更加醇厚，发酵产生的乳酸链球菌素，可抑制杂菌及多种致病菌的生长，提高食醋的稳定性[15-17]。张盟等[18]采用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和巴氏醋酸杆菌协同发酵苹果汁生产苹果醋，发现其与单菌发酵苹果醋相比，总多酚、总黄酮、维生素C及游离氨基酸含量显著增多，并可显著提高对DPPH、ABTS+和羟基自由基的清除能力。丁玉峰等[19]利用植物乳杆菌、酿酒酵母和巴氏醋酸杆菌协同发酵葡萄果汁，结果发现其与葡萄果汁相比，总酚和总黄酮含量增加，对DPPH和ABTS+自由基的清除能力分别提高了51.45%和82.23%。

本研究拟采用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多菌种协同发酵苦瓜的方式，制备苦瓜醋，并对其发酵过程中的理化指标、有效成分及抗氧化活性和对胆酸盐的结合能力进行初步的探究，观察苦瓜发酵前后的成分及活性变化情况，以期为苦瓜发酵产品的研发提供参考依据，也为更好地开发和利用苦瓜资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦瓜：市售；乳酸菌（植物乳杆菌）：台湾亚芯生物科技有限公司；葡萄酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌（沪酿1.01号醋酸菌）：上海迪发酿造生物制品有限公司；DPPH（分析纯）：酷尔化学科技（北京）有限公司；水杨酸、七水合硫酸亚铁、30%过氧化氢（均为分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；Tris-HCl缓冲液、焦性没食子酸（分析纯）、牛磺胆酸钠（分析纯）、甘氨胆酸钠（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；MRS液体培养基：凯瑞生物科技有限公司。

醋酸菌活化培养基：葡萄糖1%、酵母浸粉1%、乙醇4%，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

UV-1600B型紫外分光光度计：陕西科仪实验室系统维护工程有限公司；DHP-9052B型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；Trace 1300气相色谱（gas chromatography，GC）仪、U3000高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：赛默飞世尔仪器有限公司；pH计、ME204E/02型精密分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 苦瓜醋的制备

乳酸菌活化：取适量植物乳杆菌菌粉接种于MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养8～12 h，得乳酸菌活化液[20]。

酵母菌活化：将葡萄酒高活性干酵母按0.4 g/L接种至5%的糖水中，于37 ℃恒温活化10～15 min，至液面有均匀的气泡产生，即活化成功[9]。

醋酸菌活化：按1 g/L的接种量取适量醋酸菌接种至已灭菌醋酸菌活化培养基中，于30 ℃恒温培养2～3 d，至发酵液pH≤4.5，总酸含量≥10 g/L（以醋酸计），即醋酸菌活化成功[9]。

苦瓜原液制备：称取质地完好的苦瓜干品200 g，加适量水煎煮90 min后，过滤，滤液浓缩至1 L，制得苦瓜原液。

苦瓜醋的制备：用白砂糖调苦瓜原液的可溶性固形物至17°Bx，然后将活化好的乳酸菌活化液按3%（V/V）的接种量接入已调糖苦瓜未发酵液中，于37 ℃无氧发酵24 h，之后再接入活化好的酵母菌，于28 ℃无氧共发酵10 d左右，60 ℃灭菌30 min后，再接入活化好的醋酸菌，于30 ℃有氧发酵50 d左右，制得苦瓜醋。

1.3.2 理化指标检测

总酸测定：参照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》[21]；pH 测定：参照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》[22]；乙醇测定：参照GB/T5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[23]中的气相色谱法进行；总糖测定：按照参考文献[9]采用蒽酮-硫酸法进行测定。粗多糖：参照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》[24]测定；多酚：参照GB/T 31740.2—2015《茶制品第2部分：茶多酚》[25]测定；总黄酮：参照SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》[26]测定；有机酸：参考GB 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》[27]测定；短链脂肪酸：参考文献[28]的方法测定。

1.3.3 体外抗氧化活性研究

DPPH自由基清除能力：参考文献[29]进行检测；超氧阴离子自由基清除能力：参考文献[30]采用邻苯三酚法进行测定；羟基自由基清除能力：参考文献[31]采用水杨酸法进行测定。

1.3.4 结合胆酸盐能力研究[32-36]

人工胃液、人工肠液：按中国药典2020版配制[32]。

取样品液1 mL于具塞试管中，加入1 mL人工胃液，在37 ℃恒温振荡消化1 h。然后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.8，随后加入4 mL人工肠液，37 ℃恒温振荡消化1 h。每个样品中加入4 mL胆酸盐溶液（甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐），37 ℃恒温振荡1 h，4 000 r/min离心20 min。精密量取2.5 mL上清液，加入质量分数为60%的硫酸溶液7.5 mL，混匀，70 ℃水浴加热20 min，取出，迅速冰浴5 min后，在波长387 nm处测定吸光度值。加样品加胆酸盐组记为Ai，加样品不加胆酸盐组记为Aj，不加样品加胆酸盐组记为A01，不加样品不加胆酸盐组记为A02，每个样品平行测定3次。

采用相同质量的检测样及考来烯胺，同法测定。对胆酸盐吸附率进行计算，其计算公式：

1.3.5 数据处理

试验数据采用Origin 2021、SPSS 22.0 数据分析软件进行分析处理及作图。

2 结果与分析

2.1 理化指标测定结果

微生物在发酵过程中pH和总酸的变化在一定程度上显示了发酵的情况[37]。由图1（a）可知，在发酵的前10天，主要进行乳酸菌和酵母菌发酵，乳酸菌无氧发酵产生乳酸，酵母菌无氧发酵产生乙醇和CO2，pH值迅速下降随之平稳，总酸缓慢上升。在发酵的第10天，加入醋酸杆菌，醋酸杆菌在有氧条件下利用乙醇生成乙酸和水[29]，总酸含量迅速上升，在第40天达到最高为（53.06±0.56）g/L，pH值降低随之趋于平稳。

图1 苦瓜发酵过程中总酸含量和pH（a）、乙醇（b）及总糖（c）含量的变化Fig. 1 Changes of total acid contents and pH (a),contents of ethanol (b) and total sugar (c) during Momordica charantia fermentation

酵母菌发酵利用糖产生乙醇等代谢产物，乙醇含量的高低直接影响后期醋酸菌发酵产乙酸等代谢产物含量的高低，也是判定发酵液是否正常的重要指标之一[35]。由图1（b）可知，在无氧条件下，酵母菌不断消耗糖等产生乙醇，乙醇含量稳步上升至无显著变化，在发酵的第10天，乙醇含量达到（7.47±0.27）%。在发酵的第10～40天，醋酸菌主要通过消耗乙醇产生乙酸等，乙醇含量逐渐降低。在发酵的第40～60天内，乙醇减少缓慢至无显著变化，第60天乙醇含量为（0.01±0.001）%，醋酸菌发酵基本结束。

糖是微生物生长重要的营养物质，糖含量的变化也是判定发酵是否正常的重要指标之一[38]。由图1（c）可知，在发酵的前5 d，酵母菌利用糖转化生成乙醇，乙醇含量逐渐升高，总糖含量不断减少，在发酵的第5～10天，总糖含量减少缓慢至无显著变化，酵母菌发酵基本结束，在第10天，总糖含量为（8.12±0.57）mg/mL。在发酵的第10～60天内，主要进行醋酸菌发酵，总糖含量无明显变化，在第60天醋酸菌发酵基本结束，总糖含量为（7.07±0.76）mg/mL。

2.2 苦瓜发酵前后有效成分含量的变化

2.2.1 苦瓜发酵前后粗多糖、多酚及黄酮含量的变化

本实验对苦瓜发酵前后的粗多糖、多酚、黄酮含量进行测定，探究苦瓜发酵前后有效成分含量的变化情况，结果见图2。

图2 苦瓜发酵前后粗多糖、多酚及黄酮含量的变化Fig. 2 Changes of contents of crude polysaccharides,polyphenols and flavonoids before and after Momordica charantia fermentation

由图2可知，苦瓜发酵后粗多糖含量显著下降，由发酵前的（24.81±0.38）mg/mL下降至（6.55±0.47）mg/mL，表明粗多糖在发酵过程中被微生物分解利用。多酚和黄酮含量相比发酵前有所上升，分别由发酵前的（0.712±0.026）mg/mL和（0.238±0.045）mg/mL上升至（1.039±0.086）mg/mL和（0.516±0.080）mg/mL，可能是由于发酵过程中微生物作用有助于多酚类物质的溶出和单体酚类物质的合成[39]，从而提高了多酚、黄酮含量。

2.2.2 苦瓜发酵前后有机酸及短链脂肪酸含量的变化

对苦瓜发酵前后有机酸及短链脂肪酸含量进行测定，结果见表1。由表1可知，以相同质量浓度的苦瓜原液为对照，苦瓜醋中草酸含量显著下降（P＜0.01），乳酸、琥珀酸含量显著增加（P＜0.01），此外发酵还产生了乙酸和丙酸；酒石酸、富马酸含量有所下降（P＜0.05）；柠檬酸含量无显著变化（P＞0.05）。不同物质含量的变化与微生物发酵过程中物质之间的相互转化密切相关。

表1 苦瓜发酵前后有机酸及短链脂肪酸含量的变化Table 1 Changes of contents of organic acids and short-chain fatty acids before and after Momordica charantia fermentationmg/mL

2.3 抗氧化活性结果分析

将不同体积分数的苦瓜原液和苦瓜醋进行清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基能力对比，结果见图3。

图3 苦瓜发酵前后对DPPH自由基（a）、超氧阴离子自由基（b）、羟基自由基（c）的清除能力Fig. 3 Scavenging ability of DPPH radicals (a),superoxide radicals (b)and hydroxyl radicals (c) before and after Momordica charantia fermentation

由图3（a）可知，在体积分数为10%～50%范围内，苦瓜原液和苦瓜醋对DPPH自由基的清除能力都在缓慢增加。在体积分数为50%时，苦瓜原液的DPPH自由基的清除率为（41.69±1.90）%，苦瓜醋为（74.79±2.19）%。总体上，苦瓜醋清除DPPH自由基的能力明显强于苦瓜原液，推测苦瓜发酵过程中释放的酚类物质具有较强的抗氧化活性[40]，使得苦瓜醋表现出较强的抗氧化活性。

由图3（b）可知，在体积分数为5%～25%范围内，苦瓜发酵前后对超氧自由基都有一定的清除能力。当体积分数为25%时，苦瓜原液的超氧阴离子自由基的清除率为（62.74±0.47）%，苦瓜醋为（95.42±2.05）%。本次试验结果表明，苦瓜经过发酵之后对超氧阴离子自由基的清除能力显著提升，推测发酵产生的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化物质使苦瓜醋具有较强的清除活性氧的作用[41]。

由图3（c）可知，在体积分数为5%～20%区间内，苦瓜原液对羟基自由基的清除能力始终低于苦瓜醋，在20%～25%区间内，两者逐渐趋于平稳。当体积分数为25%时，苦瓜原液的羟自由基的清除率为（94.53±1.14）%，苦瓜醋为（96.77±1.57）%，结果显示，苦瓜醋对羟自由基的清除能力是略强于苦瓜原液的。

2.4 苦瓜发酵前后结合胆酸盐能力的研究

在体外条件下，模拟人体胃肠道环境进行胆酸盐结合实验，分析不同样品对胆酸盐的吸附能力，结果见表2。

表2 苦瓜发酵前后结合甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的能力Table 2 Combining ability of sodium glycinecholate and sodium taurine before and after Momordica charantia fermentation

本试验以考来烯胺作为参照品可直观的看出降脂的效果[42]。由表2可知，以1 mg/mL的考来烯胺作对照，相同质量的苦瓜原液和苦瓜醋对甘氨胆酸钠的结合能力依次为考来烯胺＞苦瓜原液＞苦瓜醋，苦瓜原液和苦瓜醋的甘氨胆酸钠结合率与阳性对照均有极显著差异（P＜0.01）；对牛磺胆酸钠的结合能力依次为考来烯胺＞苦瓜原液＞苦瓜醋，苦瓜原液和苦瓜醋的牛磺胆酸钠结合率与阳性对照均有极显著差异（P＜0.01）。

由表2亦可知，苦瓜醋结合甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的能力是高于苦瓜原液的，说明苦瓜经过多菌种发酵后，代谢产生的成分变化在一定程度上能够提高苦瓜结合胆酸盐的能力，提高降脂能力。

3 结论

本实验将苦瓜水提液经乳酸菌、酵母菌、醋酸菌发酵，结果显示多酚、黄酮含量分别比发酵前提高了45%、117%。此外，乳酸、琥珀酸含量显著增加，并发酵产生了乙酸和丙酸，说明发酵有利于增加有机酸及短链脂肪酸的种类及含量。抗氧化试验表明，苦瓜醋对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力强于苦瓜原液，表明苦瓜醋具有较好的抗氧化活性。从体外结合胆酸盐的能力分析，苦瓜醋结合胆酸盐的能力强于苦瓜原液，且差异显著（P＜0.01），具有较好的体外降脂能力。但人体的胃肠道是一个复杂的环境，存在多种酶促反应，体外结合胆酸盐试验只是在模拟人体的肠道环境，因此苦瓜醋在人体胃肠道内是否能取得同样的效果，还需要进一步探究。