齐墩果酸对衰老大鼠睾丸间质细胞胰岛素/IGF1通路关键基因表达的影响

李少华牛双董子怡宋邑诚牛嗣云

(1.河北大学附属医院 新生儿科,河北 保定 071000;2.河北大学 基础医学院,河北 保定 071000)

老化是机体在年龄增长过程中表现出的形态变化、功能衰退和新陈代谢障碍的综合状态[1].男性生殖衰老特点是血浆和睾丸中睾酮水平的持续性降低、生精小管改变、生精功能低下[2].齐墩果酸是一种天然的五环三萜,广泛存在于包括紫荆、女贞子、葡萄和接骨木等近200 多种植物中[3].据报道齐墩果酸具有降血脂[4]、保护肝脏[5]和恢复睾丸功能[6]等功效,并且齐墩果酸通过其抗炎抗氧化活性发挥神经保护性作用[7],但其对男性生殖衰老的影响及可能的分子机制尚无报道.胰岛素/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)信号通路调控着各种细胞活动,包括生长、增殖和分化等,在哺乳动物性发育和睾丸功能发挥中起关键作用[8].本文旨在探讨齐墩果酸通过胰岛素/IGF1通路延缓男性生殖衰老.

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验用SPF级Wistar大鼠购自河北医科大学实验动物管理中心 (动物许可证号1510063),饲养于河北大学医学部实验动物管理中心,许可证号:SYXK(冀)2017-002.取4只2月龄雄鼠和2月龄雌鼠合笼,繁殖新生鼠,用于后续实验.

1.2睾丸间质细胞的培养与鉴定

17～25 d Wistar大鼠,颈椎脱臼处死,以无菌操作方式取出双侧睾丸,无菌预冷PBS中分离脂肪垫和筋膜,保持睾丸的完整性.采用Ⅰ型胶原酶处理睾丸以获得生精小管周围的间质细胞.将细胞培养在含体积分数为10%的胎牛血清(Biological Industries,以色列)的DMEM/F12培养液(Gibco,美国)中,以1×107/m L的密度铺匀,1 h后换液.然后进行细胞鉴定,即加入3β-羟类固醇脱氢酶,灰色为鉴定成功[9].融合度到达80%左右时,按照第1代和第2代1∶2比例传代,传到第3代以后,铺于6孔板内,密度为1×106/m L,培养2 d后备用.

1.3 MTT确定齐墩果酸作用最适浓度及时间

将齐墩果酸(成都植标化有限公司,中国)溶于无血培养基中,其终浓度设定为0、20、40、60、80μmol/L,作用时间设定为24、48、72 h,分别作用于已培养了2 d的睾丸间质细胞,用酶标仪检测不同组的吸光度,计算细胞活力,选定细胞活力最佳组的作用浓度及作用时间.

细胞活力=Ai/A0,其中,Ai为各组吸光度;A0为对照组吸光度.

1.4 细胞衰老模型建立及分组

氧化应激创建细胞衰老模型,将其分为正常组、衰老组和齐墩果酸组.处理方式见表1.

1.5 β-半乳糖苷酶染色

将各组细胞移除其培养液,预冷PBS清洗2次.β-半乳糖苷酶试剂盒(碧云天,中国)染色,蓝绿色的细胞质为阳性细胞.显微镜(200倍)观察,记录其数目,每组观察10个视野,计算平均阳性率.重复3次独立实验.

1.6 胰岛素/IGF1信号通路关键基因INSR、IRS 1、IRS 2、IGF 1和IGFBP 3的表达情况

1.6.1 RT-qPCR

1.6.2 免疫荧光

将所有组细胞去除其培养液,PBS清洗2次.常温,体积分数为4%的Paraformaldehyde固定30 min.常温,体积分数为0.5%的Trition X-100(Sigma, 美国)通透20 min,预冷PBS清洗2次.常温,质量浓度为50 g/L的完达山奶粉溶液封闭45 min.4℃,加入INSR、IRS1、IRS2、IGF1和IGFBP3(Santa Cruz,美国)一抗过夜.次日,PBS洗5次.37℃,加入二抗(Abways,中国)孵育30 min,PBS洗5次.封片.各组爬片3张,荧光显微镜观察,随机选取10个视野,重复3次,Image J软件计算各组图片光密度.

1.6.3 免疫印迹

将各组细胞移除其培养液,加入含PMSF(体积比为1∶100)的RIPA 裂解液,BSA 法测定各组蛋白浓度.统一取60μg细胞蛋白裂解物,SDS-PAGE电泳,转膜.常温,质量浓度为50 g/L的完达山奶粉溶液封闭0.5 h.4℃,加入INSR、IRS1、IRS2、IGF1、IGFBP3(Proteintech,中国)和β-actin(Proteintech,中国)的一抗孵育过夜.次日,PBS-T 洗膜5次.常温,加入抗兔二抗(Proteintech,中国)孵育2 h,PBS-T 冲洗5次.将膜和发光液接触后,显影.生物学重复3次,Image J软件计算条带灰度值,内参为β-actin.

1.7 齐墩果酸对睾丸间质细胞凋亡率的影响

1.7.1 INSR 抑制剂最适作用浓度及时间的确定

衰老组细胞加入BMS-754807(MedChem Express 公司,美国),最终浓度设定为2.5、5、10μmol/L,作用时间设定为24、48、72 h,然后检测胰岛素/IGF1信号通路下游基因Bcl-2(引物序列见表2)的转录情况,确定抑制剂的最适浓度及作用时间.

表2 基因引物序列Tab.2 Gene primer sequences

1.7.2 流式细胞术对细胞凋亡率的检测

衰老组和齐墩果酸组处理方法见表1,INSR 抑制剂组是在齐墩果酸组的基础上加入终浓度为5μmol/L的INSR 抑制剂,作用24 h后去除.凋亡检测试剂盒(Vazyme公司,中国)染色,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,生物学重复3次.

1.8 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析.先进行正态分布检验,后进行方差齐性检验,两两比较,齐则采用最小显著差法,不齐则采用Dunnett′s t3检验,P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 齐墩果酸最佳作用浓度及时间的确定

MTT 结果显示,齐墩果酸作用24 h,不同浓度处理组的细胞活力无明显差异,且各处理组细胞活力较低;作用48 h,细胞活力随齐墩果酸浓度的增加而下降;作用72 h,20μmol/L 齐墩果酸处理组细胞活力最高,总体比较,齐墩果酸作用浓度及作用时间确定为20μmol/L,72 h(图1).

图1 不同浓度的齐墩果酸对睾丸间质细胞活力的影响Fig.1 Effects of oleanolic acid of different concentration on cellular activity of leydig cells

2.2 睾丸间质细胞衰老模型的鉴定

β-半乳糖苷酶经染色后阳性细胞质呈青绿色,结果表明,与正常组相比,衰老组中细胞质青绿色非常明显,经统计,阳性细胞即衰老细胞在60%以上(P＜0.05)有统计学意义(图2).

图2 β-半乳糖苷酶染色结果Fig.2 Results ofβ-galactosidase staining

2.3 齐墩果酸对睾丸间质细胞胰岛素/IGF1通路关键基因表达的影响

2.3.1 齐墩果酸对INSR、IRS1、IRS2、IGF1和IGFBP3的m RNA 转录水平的影响

衰老组中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的m RNA 转录水平比正常组显著降低 (P＜0.05),IGFBP3转录水平显著升高 (P＜0.05).齐墩果酸组能明显提高衰老细胞中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的mRNA 转录,降低IGFBP3的m RNA 转录(P＜0.05)(图3).

图3 睾丸间质细胞中INSR、IRS 1、IRS 2、IGF 1和IGFBP 3的mRNA转录水平Fig.3 mRNA transcription levels of INSR,IRS1,IRS2,IGF 1 and IGFBP 3 in leydig cells

2.3.2 齐墩果酸对INSR、IRS1、IRS2和IGF1的蛋白翻译水平的影响

免疫荧光结果显示,发红色荧光的为阳性产物(图4a).睾丸间质细胞衰老组INSR、IRS1、IRS2、IGF1的平均吸光度(OD)值比正常组有所减少(P＜0.05),IGFBP3无荧光未展示.齐墩果酸组INSR、IRS1、IGF1的平均OD 值比衰老组有所增加(P＜0.05)(图4b).INSR、IRS1、IRS2和IGF1的免疫印迹趋势与免疫荧光结果一致(图4c-d).间质细胞能够分泌IGFBP3,但不表达IGFBP3蛋白,这表明,间质细胞分泌的IGFBP3可能主要作用于支持细胞和生精细胞.

图4 睾丸间质细胞中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的蛋白表达情况Fig.4 Protein expression of INSR,IRS1,IRS2 and IGF1 in leydig cells

2.4 齐墩果酸对睾丸间质细胞凋亡的影响

2.4.1 胰岛素/IGF1通路受体抑制剂BMS-754807最适作用浓度及时间的确定

抗凋亡基因Bcl-2为胰岛素/IGF1的下游靶基因,抑制通路蛋白可抑制Bcl-2的表达,通过RT-qPCR 检测Bcl-2的转录情况来确定抑制剂的最佳作用浓度及时间.研究结果显示,抑制剂的作用浓度为5μmol/L,作用时间为24 h,此时Bcl-2的转录水平明显低于对照组(P＜0.01)(图5).

图5 不同浓度抑制剂BMS-754807处理后睾丸间质细胞中Bcl-2 mRNA的转录情况Fig.5 Transcription of Bcl-2 mRNA in leydig cells after treatment with different concentrations of inhibitors

2.4.2 齐墩果酸对衰老的睾丸间质细胞凋亡的影响

检测衰老组、齐墩果酸组和抑制剂组睾丸间质细胞凋亡率,结果显示齐墩果酸能明显降低衰老组睾丸间质细胞的凋亡率(P＜0.05);加入INSR 抑制剂后,细胞的凋亡率有所增加(P＜0.05),表明齐墩果酸可能是通过激活INSR 来减少衰老细胞的凋亡率(图6).

图6 齐墩果酸对衰老诱导的睾丸间质细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of oleanolic acid on the apoptosis of leydig cells

3 讨论

本研究引入了胰岛素受体特异性抑制剂BMS-754807,将细胞分为了衰老组、齐墩果酸组和抑制剂组.流式细胞术结果显示,齐墩果酸明显降低衰老后的睾丸间质细胞凋亡率,添加抑制剂后能阻断此现象的发生,表明齐墩果酸可能是通过激活INSR 来减少衰老细胞的凋亡率.

综上可知,齐墩果酸调节胰岛素/IGF1通路关键基因表达,激活INSR 降低衰老睾丸间质细胞凋亡率,延缓睾丸间质细胞衰老.齐墩果酸在体内延缓衰老的作用还需要进一步探究,但此研究结果为齐墩果酸延缓男性生殖衰老奠定了理论基础.