马铃薯淀粉的场流分离表征过程回收率研究

张文惠宋天歌孙瑜珊申世刚窦海洋

(1.河北大学 化学与环境科学学院,河北 保定 071002;2.河北大学 河北省炎性自身免疫性疾病发病机制及防治重点实验室,基础医学院,河北 保定 071000)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)环境适应性强,种植地域广,营养丰富且兼顾保健功能,被中国列为第四大主粮化战略对象[1],其全粉保留了马铃薯天然的味道和养分,凝胶化温度低、膨胀度大、聚合度高、吸水性强、黏度和透明度高,通常被用于食品和制药行业.马铃薯中淀粉质量分数占干物质的70%～85%,且粉质光滑,色白泽优,糊化后呈透明胶状,常被用于无蛋白质烘焙、烹饪佐味料和功能性食品配料等[2].马铃薯淀粉的结构影响其理化性质和含马铃薯淀粉食品的品质.因此,其结构的准确表征对于马铃薯淀粉产品的质量控制至关重要.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Eclipse AF4场流分离系统(德国Wyatt公司)在线串联DAWN EOS多角度激光光散射检测器(美国Wyatt公司)和1260示差折光检测器(美国Agilent公司);马铃薯购自当地超市(河北,保定);叠氮化钠(NaN3)、硝酸钠(Na NO3)、亚硫酸氢钠(Na HSO3)和氢氧化钠(NaOH)购自上海麦克林生化科技有限公司;质量分数37%盐酸(HCl)购自北京化工厂;马脾铁蛋白和牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma-Aldrich公司;使用的试剂均为分析级.超纯水由美国Milli-Q Advantage A10超纯水系统制得.

1.2 马铃薯淀粉样品的制备

1.2.1 马铃薯淀粉粗粉的提取

马铃薯500 g,去皮后切成小块,添加1 g/L NaHSO3溶液后,置于山东九阳JYL-C52V型搅拌机中磨浆,浆液依次经过80目(孔径178μm)和200目(孔径75μm)筛后,转入2 L玻璃烧杯中静置5 h,除去上清液和杂质层.采用超纯水重悬沉淀,转入2 L玻璃烧杯后静置3 h弃上清液,反复5次,将获得的马铃薯淀粉转入蒸发皿中,置于上海新苗DHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱中45℃烘干,转入具塞密封管中室温保存.

1.2.2 马铃薯淀粉的纯化

准确称取10.0 g马铃薯淀粉粗粉,加入150 m L 1.8 g/L NaOH 溶液,40℃水浴中搅拌2 h(300 r/min),转移到50 m L 离心管中,室温6 000 r/min离心10 min,收集下层白色沉淀.加超纯水调节p H 至7.00,室温离心10 min(6 000 r/min),水洗2次后,用体积分数50%的乙醇洗3次,无水乙醇洗2次,45℃烘干,研磨后200目(孔径75μm)筛分,得到纯化的马铃薯淀粉.

1.2.3 马铃薯淀粉的溶解

准确称取15.0 mg纯化的马铃薯淀粉,置于20 m L螺塞玻璃瓶,加入1.5 m L NaOH 溶液(1 mol/L).室温下,置于北京大龙MS-H550-Pro磁力搅拌器搅拌至透明无块状凝胶(200 r/min),转入80℃水浴,磁力搅拌4 min(400 r/min),加入80℃的超纯水使体积达到6.0 m L,继续在80℃、400 r/min搅拌2 h,加入1.5 m L HCl溶液(1 mol/L)中和马铃薯溶液,继续搅拌1 min,自然冷却至室温,待AF4分析[3,14].

1.3 马铃薯淀粉的AF4分析

AF4系统仪器配置和洗脱程序与张靖等[13]报道一致.使用马脾铁蛋白测得池道高度为287μm,使用BSA 验证了AF4系统的稳定性,具体步骤见文献[13].使用ASTRA 7.1.3软件(美国Wyatt公司)和Berry模式分析AF4数据,采用0.146 m L/g为淀粉的绝对折射率增量[15].

2 结果与讨论

2.1 载液离子强度对马铃薯淀粉回收率的影响

淀粉分子间斥力随着载液离子强度的增加而增大,使得柔性淀粉分子的有效体积增加,进而影响样品的保留时间和回收率[16].在中性条件下,研究了不同离子强度NaNO3载液对马铃薯淀粉回收率的影响(图1).图1a中5 min处洗脱峰为AM,12.5 min洗脱峰是AP.结果显示,样品峰的分离度和保留时间随NaNO3浓度增加而增大.不同载液离子强度下的马铃薯淀粉样品的回收率列于表1.NaNO3浓度为1 mmol/L时,样品的回收率最大(93.83±0.01)%;随着NaNO3浓度增加(5、50、100 mmol/L),马铃薯淀粉的回收率逐渐降低,分别为(91.80±0.01)%、(87.77±0.02)%、(86.43±0.01)%.这主要是因为随着载液离子强度的增加,双电层厚度降低,样品更接近于超过滤膜表面,导致样品与超过滤膜表面交联增大.综合考虑样品分离度和回收率,选择5 mmol/L NaNO3(p H 7.00,包含3 mmol/L NaN3)作为后续AF4分析的载液.

表1 马铃薯淀粉在不同AF4分析条件下的回收率(n=3)Tab.1 Recovery of potato starch obtained under various AF4 run conditions(n=3)

图1 不同离子强度下马铃薯淀粉的AF4-MALS-dRI图谱、回转半径(a)和分子摩尔质量(b)分布Fig.1 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different ionic strengths

2.2 样品进样量对马铃薯淀粉回收率的影响

样品过载不仅影响洗脱峰,而且影响样品回收率[17].图2为不同进样量的马铃薯淀粉AF4洗脱图谱.马铃薯淀粉进样量为10μg 时,回收率最高(97.73±0.01)%,但AF4-MALS-d RI信号强度较弱.AF4-MALS-d RI信号强度随马铃薯淀粉进样量的增加而增大,回收率逐渐减小.马铃薯淀粉进样量为25μg时,回收率最小(91.80±0.01)%,同时空隙峰的强度明显增加,说明部分样品从空隙峰中洗脱出来.此外,峰展宽增大,出现样品过载现象.综合考虑样品分离度和回收率,选择马铃薯样品进样量为15μg作为后续AF4分析的进样量.

图2 不同进样量下马铃薯淀粉的AF4-MALS-dRI图谱、回转半径(a)和分子摩尔质量(b)分布Fig.2 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different injection mass

2.3 交叉流流速对马铃薯淀粉回收率的影响

AF4是通过外力(交叉流)与样品自身布朗运动产生的扩散力相互作用而达到分离目的.淀粉分子具有较宽的尺寸分布,使用恒定交叉流流速分离时,保留时间长,样品与超过滤膜间交联严重,导致样品回收率和准确性较差.该研究使用梯度洗脱模式,即AF4聚集过程结束后,交叉流流速指数衰减模式降低到0.05 m L/min(半衰期为3.0 min).在保证分离度的前提下,缩短了分析时间,减少了样品与超滤膜之间的交联.由图3可见,初始交叉流流速为0.8 m L/min时,马铃薯淀粉的分离度最小,回收率最高(96.03±0.01)%;随着初始交叉流流速增加(1.0 mL/min),样品层更接近于超滤膜,样品与超滤膜交联增强,导致马铃薯淀粉的保留时间增长,洗脱峰展宽,样品回收率降为(94.80±0.03)%;当初始交叉流流速为1.2 m L/min,AF4-MALS-d RI检测的回转半径(radius of gyration,Rg)较0.8 m L/min时大,说明在AF4聚集过程中,马铃薯淀粉分子间相互作用增大,导致部分样品发生聚集,此时回收率为(93.43±0.02)%.综合考虑样品分离度以及回收率,选择交叉流流速为1.0 m L/min.

图3 不同交叉流流速下马铃薯淀粉的AF4-MALS-dRI图谱、回转半径(a)和分子摩尔质量(b)分布Fig.3 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different cross-flow rates

2.4 聚集时间对马铃薯淀粉回收率的影响

在AF4分离过程中,样品组分需要在沿通道洗脱之前达到平衡才能获得有效的分离.为了减小样品峰展宽,应在样品注入AF4通道后增加聚集时间,使样品平衡分布层形成的条带尽可能窄.采用溴酚蓝(BPB)初步确定聚集时间.图4为不同聚集时间马铃薯淀粉的AF4洗脱图谱.随着聚集时间的增加,马铃薯淀粉样品的分离度增大,样品回收率减小(表1).当聚集时间为2.7 min时,样品间的接触时间长,导致部分样品发生聚集.由表1可见,随着聚集时间的增加(2.0、2.5、2.7 min),样品回收率逐渐降低,分别为(98.20±0.02)%、(97.30±0.02)%和(95.87±0.02)%.综合考虑样品间相互作用和回收率,选择聚集时间为2.5 min.

图4 不同聚集时间下马铃薯淀粉的AF4-MALS-dRI图谱、回转半径(a)和分子摩尔质量(b)分布Fig.4 AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions of potato starch obtained with different focusing time

2.5 方法的重复性

图5 马铃薯淀粉样品的AF4-MALS-dRI图谱、回转半径(a)和分子摩尔质量(b)分布的重复性Fig.5 Repeatability in terms of AF4-MALS-dRI fractograms,radius of gyration(a)and molar mass(b)distributions for analysis of potato starch

2.6 马铃薯淀粉的结构表征

图6 马铃薯淀粉的分子构象(a)、片段Ⅰ(b)、片段Ⅱ(c)、片段Ⅲ(d)Fig.6 Conformation of potato starch (a),domain Ⅰ(b),domain Ⅱ(c),domainⅢ(d)

3 结论

本文研究了在AF4 系统的检出范围内影响样品回收率的因素,在载液(含5 mmol/L Na NO3、3 mmol/L NaN3)p H 7.00,样品进样量15μg,交叉流流速1.0 m L/min,聚集时间2.5 min的条件下,马铃薯淀粉的回收率为(97.30±0.02)%,提高了AF4-MALS-d RI联用技术分离表征马铃薯淀粉结构的准确性.在分子层面上,马铃薯淀粉的AM 的分子构象既包括致密球形也包括柔性无规线团结构,而AP则多为柔性线团结构,少数为高度支化和密集堆积的结构.在分离表征马铃薯淀粉过程中,AF4-MALS-d RI具有良好的重复性.该研究可为马铃薯淀粉类食品的开发提供数据参考.