基于RT-PCR对低温沼气发酵过程中巴氏德醋杆菌的分析

代金平, 冯 蕾, 谢玉清, 王志方, 陈 竞, 王小武,3,

周留艳1,2, 张慧涛1,2, 古丽·艾合买提1,2, 杨新平1,2,3*

(1.新疆农科院微生物应用研究所， 新疆 乌鲁木齐 830091； 2. 新疆特殊环境微生物重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830091； 3. 新疆万康诚一肥业有限公司, 新疆 乌鲁木齐 831201)

沼气发酵过程中维持产气盛期的条件是厌氧产酸、厌氧氨化和产甲烷细菌的快速增殖以及相互协调生长。沼气发酵初期，由厌氧和兼性厌氧的水解细菌或发酵细菌将纤维素、淀粉等水解成单糖，进一步形成丙酮；将蛋白质水解成氨基酸，再进一步形成有机酸的氨；将脂类水解为甘油和脂肪酸，进一步形成乙酸、丙酸、丁酸、乙醇等；接下来，由产氢产乙酸细菌利用第1阶段合成的有机酸，氧化分解成乙酸和分子氢；最后再由严格厌氧的产甲烷细菌群完成。醋酸菌(aceticacidbacteria, AAB)是一类严格好氧的革兰氏阴性细菌。醋酸菌常见于气候温暖、空气湿润的区域。1898年Beijerinck[1]确定了醋杆菌属具有氧化乙醇生成乙酸的能力。巴氏德醋杆菌(Acetobacterpastcurianum, AP)能够在低温条件下提高牛羊粪沼气产量，同时也可增加沼气发酵残渣纤维素含量。研究低温沼气发酵过程中AP菌 16S rDNA基因的拷贝数，对低温沼气发酵过程中产甲烷阶段有重要的指导意义。前人通过传统的分离培养的方法一般不能全面准确地了解沼气发酵微生物。对于其在低温条件下外源添加剂促进沼气发酵的研究比较缺乏。现已报道的微生物分子生物学技术有RFLP技术、ARDAR技术和PCR-DGGE技术等[2-4]。荧光定量 PCR 技术是以PCR技术(指聚合酶链式 反应技术)为基础，将荧光能量传递技术融入到了PCR仪器的应用中，利用反应体系中荧光染料或荧光基因的显示，观测模板浓度变化，借此实现对未知模板浓度的预测。该技术实现了对 PCR 的优化和提升，既解决了PCR污染环境的问题，同时也提升了其特异性和自动化水平[5-6]。唐凤[7]等利用实时荧光定量PCR技术建立了乌鲁木齐10号冷泉泉水细菌群落的定量分析体系。王彦伟[8]等利用 DGGE 及 Real-Time PCR 技术对不同地区低温沼气池中沼泥行进发酵前期、后期产甲烷古菌群落变化进行了研究。本研究利用这些技术可以研究发现沼气发酵过程中不同阶段产甲烷微生物群落的种类随着料液浓度和pH值变化的规律。本文应用实时荧光定量PCR技术，对低温下(15℃)牛粪沼气反应器中添加的AP菌发酵样品进行定量分析，为低温沼气过程中添加促进菌剂的相关作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基制备

(1)FC2液体培养基制备称取酵母膏2.5 g，蛋白胨1.5 g，Na2HPO31.0 g，蔗糖10 g，置于1.0 L的三角烧瓶中，加去离子水500 mL，调至pH值为7.0左右，高压灭菌，备用。

(2)实验室自筛菌株液体培养基制备：将AP菌在无菌操作台接种于已经灭菌后的FC2液体培养基中，120 rpm， 30℃培养24 h，备用。

1.1.2 实验药品与仪器

酵母膏，蛋白胨，Na2HPO3，蔗糖，2×Taq PCR MasterMix，罗氏荧光定量试剂盒，所用水为去离子水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

称取自然晾干，粉碎后的牛粪240 g分别装于2 L发酵瓶中，再分别加入自筛促进菌剂配伍，按照以下配伍添加：配伍I(1 g 固体ZHC)；配伍II(5 g 固体ZHC)；配伍III(2.0 g 固体酱渣+ Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg·L-1)；配伍Ⅳ(5 mL液体ZHC菌)；配伍Ⅴ(Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg·L-1)，配伍Ⅵ(1 mL液体ZHC菌+Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg·L-1)，配伍VII(5 mL液体ZHC菌+Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg·L-1)最后加水至1500 g，混匀，连接集气装置，制备模拟沼气发酵罐，置于15 ℃恒温培养，CK1为15℃空白对照(不添加任何外源物)，CK2为30℃空白对照(不添加任何外源物)。在发酵过程中，分别在发酵第0天、30天、60天、180天取50 mL发酵沼液样品进行后续分析。本研究试验于新疆特殊环境微生物重点实验室进行。

表1 样品处理表

1.2.2 日产气量的测定

产气量的测定采用液压原理，当反应装置的压力过大时，会迫使装满水的容器中的水溶液移至到另一空瓶中，每隔24 h测量量筒水的体积即为相对日产气量，连续测量180 d以上。

1.2.3 总DNA的提取

沼液总DNA提取方法参考张琳[9]等和陈竞[10]等。

1.2.4 AP菌荧光定量目标片段PCR分析及优化

分别以AP菌16S rDNA序列为模板，设计荧光定量PCR引物分别为AC5：CCTGGCTCATTACTGACG，AC4：AGCCCTGGTAAGGTTCTGC；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

优化的PCR反应条件以及反应体系如下：50 μL的体系，24 μL PCR mix，23 μL dd H20，1 μL DNA模板，引物1 μL(F-primer和R-primerge各1μL)。

反应程序为预变性90度，变性94度10 s，退火55度45 s，延伸72度10 s，35个循环。

1.2.5 AP菌 16S rDNA片段荧光定量PCR标准品制备

将单一目标条带DNA进行切胶回收，用上海生化有限公司的琼脂凝胶DNA回收试剂盒切胶回收。回收得到的目标PCR产物使用上海生工提供的DNA克隆载体试剂盒进行T载体连接，然后用热激法转化到感受态细胞(E.coliDH5α)上，并涂布到含有氨苄青霉素(AMP 0.1 mg·mL-1)的LB固体培养基上。挑取阳性菌落进行PCR扩增，反应条件及体系与PCR优化体系一致，1%凝胶电泳检测，确定重组质粒构建成功。挑取阳性菌落接种于含有氨苄青霉素(AMP 0.1 mg·mL-1)的LB液体培养基中37 ℃振荡，培养过夜。使用上海生物工程公司质粒提试剂盒进行质粒提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。测定克隆子质粒的OD(260 nm)，计算其拷贝数，然后作梯度稀释，稀释的各浓度为：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，作为荧光定量PCR的标准品。

1.2.6 样品DNAAP菌密度定量

用超微量微孔板分光光度计分别测定阳性重组质粒于260 nm和280 nm处的吸光度，并计算重组质粒的含量和纯度。将重组质粒进行10倍梯度稀释。使用20 μL的实时定量PCR的反应体系： 1μL模板DNA，17μLSYBR Premix Ex Tap(Light Cycler 480试剂盒)，引物各1μL。同时设立阴性对照。Real-Time PCR定量扩增仪型号为Light Cycler 480II。

2 结果与分析

2.1 产气量分析结果

由图1所示，在发酵0～30 d中，CK2(30℃)产气量明显高于其他处理组，且产气量达到16990 mL；在发酵31～90 d中，在15℃培养条件下，明显看出样品2>样品7>样品4>其他样品组，且产气量分别为6195 mL, 6113 mL，5723 mL；在发酵180 d内，在相同发酵条件下样品7总产气量最高，达到13915 mL。

2.2 沼液样品总DNA提取纯化结果

提取样品总DNA结果见图2。提取DNA片段大小约为20 kb以上，目标条带清晰，可进行下一步实验。

2.3 AP菌目标条带的质粒制备

如图3所示，为PUC19+引物AC45扩增条带转化后所提质粒，可从大小上判断出1、2、4、5、6、10、11号质粒为阳性克隆，随机挑取阳性质粒进行PCR，其产物用琼脂糖电泳检测，阳性重组质粒经PCR后，得到245bp的条带，反应条件及体系与PCR优化体系一致，再次将所扩增的条带进行测序验证，确定重组质粒构建成功，以备后续试验。

2.4 不同处理样品总DNA巴氏德醋杆菌荧光条带的PCR扩增优化结果

以纯化的样品总DNA为模板，进行巴氏德醋杆菌荧光条带的PCR扩增，Maker为2000 bp，获得PCR产物约为245 bp，与预计大小一致。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，与目的条带一致，可进行后续Real-Time PCR试验(见图4)。

2.5 AP菌16S rDNA片段荧光定量PCR标准品制备

测定阳性克隆子质粒的在260 nm 下的OD值，计算其拷贝数，然后作梯度稀释，选取稀释度为：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，作为标准样品进行荧光定量PCR扩增，结果显示绘制的扩增曲线，各样品平行间所测定的Cp差异<0.5 bp( Cp值是指在进行实时监测过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数)，说明样品平行间一致性较好，且每个稀释梯度样品较分明，可信度较高。将标准品放人荧光定量PCR体系中进行扩增，得标准曲线。回归方程为y=-3.024x+30.73，误差为0.0680(见图5)。

巴氏德醋杆菌(Acetobacterpastcurianum)样品DNA Real-Time PCR扩增，每个样品DNA做3个重复，Cp值相近，表明重复性较好(见图6)。溶解曲线均为单峰，进一步证明标准曲线的准确可靠(见图7)。

2.6 不同处理样品DNAAP菌16S rDNA基因的拷贝数结果

利用实时定量PCR的方法测定沼气发酵中AP菌的浓度，结果显示不同样品处理下，最高基因的拷贝数(Conc)为1.83 fg·μL-1。定量结果显示：配伍II(5 g 固体ZHC)、配伍Ⅳ(5 mL液体ZHC菌)和配伍VII(5 mL液体ZHC菌+Fe3+∶Ni2+0.1∶0.02 mg·L-1)处理后，AP菌的浓度较其他处理浓度较高，Conc分别为41.83 fg·μL-1、33.77 fg·μL-1和31.93 fg·μL-1，Conc分别比15℃对照组高出90%、54%和45.6%(见表2)。

表2 AP菌的Real-Time PCR扩增定量结果

3 讨论

(1)在近年的研究中，细菌纤维素产生菌研究最多、产量最高的细菌是产醋酸的AP菌，并且AP菌已经被作为细菌纤维素基础和应用研究的模拟微生物[11-13]。目前，醋酸杆菌发酵生产纤维素的研究仍然存在着许多的问题，但是具有较好的发展前景，应当在后续的试验中，加强相关研究和探讨。

(2)沼气发酵过程中，主要分为3个阶段:水解和发酵阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段。在沼气发酵第1阶段水解和发酵阶段中，主要是使有机物中的一些纤维素物质进行水解，给下一反应阶段提供大量的发酵底物，而AP菌在这一阶段中，可以产生大量的纤维素物质，为其提供大量的发酵底物，使沼气发酵可以更加顺利快速地完成[14]。

(3)本试验中，在发酵31～90 d中，可以看出产气量的大小是样品2>样品7>样品4>其他样品组，同时这一阶段中，AP菌16S rDNA基因拷贝数依次为41.83 fg·μL-1、33.77 fg·μL-1和31.93 fg·μL-1，相较与其他处理组，AP菌16S rDNA基因拷贝数均较高，可以初步看出，在添加AP菌后，牛粪低温沼气发酵过程中，AP菌16S rDNA基因拷贝数越高，则发酵产气量也越高。AP菌具有氧化乙醇生成乙酸的能力，为沼气发酵中期，产氢产乙酸细菌利用第1阶段合成的有机酸，氧化分解成乙酸和分子氢提供有力保障，具有一定的应用价值。

4 结论

利用实时荧光定量PCR技术监测添加AP菌的数量变化，对后续的低温沼气发酵促进菌剂的研究有着重要的意义。在后续的相关研究中结合其他分子生物学方法可以更准确地研究沼气发酵中微生物群落多样性的变化，为沼气发酵促进菌剂的筛选和制备研究奠定理论基础，从而为北方地区冬季低温沼气发酵促进菌剂的筛选奠定理论基础。