一株耐盐菌NY1的耐盐特性及机理初探

常 华， 李海红， 邹含情， 安凤秋

(西安工程大学 环境与化学工程学院， 陕西 西安 710048)

高盐环境是极端环境的一种，是指盐浓度高于1%的环境，在地球上以高盐土壤或高盐水体的形式存在。高盐环境中的微生物按照耐盐浓度的不同可以分为3类：第1类是耐盐微生物，能够耐受一定的盐度，但是在无盐条件下生长最好；第2类是嗜盐微生物，这类微生物必须在一定的盐浓度下才能生长；第3类是在盐浓度由零至饱和都可以生长，且在一定的盐浓度下生长最好，这类微生物称为万能盐微生物[1-3]。

耐盐菌具有特殊的生理结构和代谢机制，另外还能产生许多特殊的生物活性物质，因而具有广泛的应用前景。目前耐盐菌的应用主要集中于高盐废水的处理[4-5]，其他方面的用途研究相对较少。耐盐菌的耐盐机理复杂多样，已经被报道阐述的有相容性溶质的积累，细胞膜和细胞壁的稳定构造，细胞容积的调节，质膜、色素及H+泵作用，排盐作用等[6]。其中相容性溶质不仅能为细胞提供渗透保护，还能通过“优先排除模式”和热力学效应等对细胞内的生物大分子起抗热、抗旱、抗冻和抗变性等稳定作用，在酶工程、分子生物学、基因工程和化妆品工业中被广泛应用[7-8]。目前发现的相容性溶质主要包括糖类和糖苷类(海藻糖、葡萄糖苷等)、氨基酸类(谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺等)、甜菜碱类(甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱)等[9]。

菌株NY1是从活性污泥中分离出的一株耐盐菌，细胞形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列比对鉴定该菌株为假单胞菌属Pseudomonas。研究分析菌株NY1在不同NaCl浓度、盐分对菌株生长，以及NaCl浓度对菌株胞内蛋白质含量、可溶性糖含量、细胞膜相对通透性的影响，探究不同盐离子和相容性溶质对菌株耐盐性能的影响，主要目的是对该菌株的耐盐机理进行初步探究，研究目的是对该菌株的耐盐机理进行初步探究，以期为将该菌应用于高盐环境的生物修复提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

NY1是实验室从污水处理厂的活性污泥中分离得到，并鉴定其为假单胞菌属，与Pseudomonassp.的亲缘关系最近，相似度达到了96%。

1.1.2 培养基

LB培养基(g·L-1)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠5，调节pH值为7.0，超纯水定容至1L，121 ℃高温高压灭菌20 min。

1.2 菌株的耐盐特性

1.2.1 不同NaCl浓度对菌株生长的影响

探究菌株NY1在不同NaCl浓度环境下的生长特性及其耐盐能力，对于能否将其运用到含盐染料废水中具有重要参考价值。配制氯化钠浓度梯度为0%、2%、4%、6%、8%和10%的LB液体培养基，接种1mL菌液，于35 ℃，120 r·min-1摇床培养。定时取样测定菌株的OD600值，绘制出菌株的生长曲线。

1.2.2 不同盐分对菌株生长的影响

部分耐盐菌株可以在NaNO3、NaCl、Na2SO4等多种盐中生长，然而部分菌株对氯化钠有专一需求。另外有研究表明：低浓度金属离子可以促进反硝化作用，高浓度的锰离子会导致亚硝酸盐积累[10]。所以探究不同盐离子对菌株耐盐性能的影响很有必要。本实验选用NaNO3、NaNO2、Na2SO4、Na2SO3和NaHCO3这5种不同的钠盐，控制Na+浓度为0.52 mol·L-1，选用NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2这4种不同的氯盐，控制Cl-浓度为0.52 mol·L-1，分别配制培养基。接种1 mL菌液，于35 ℃，120 r·min-1摇床培养24 h后测定菌液的OD600值。

1.2.3 NaCl浓度对菌株胞内蛋白质含量的影响

1.2.3.1 绘制标准曲线

菌体内蛋白质含量的测定及标准曲线的绘制参照考马斯亮蓝法[11]。

1.2.3.2 样品中蛋白质的提取及含量测定

将菌株接种于不同盐度(0%、2%、4%、6%、8%和10%)的LB液体培养基中，培养24 h后取4 mL菌液2份，其中1份离心取菌体，制备蛋白提取液。从中吸取300 μL，测定蛋白质含量及595 nm处吸光度，代入标准曲线的方程，计算300 μL提取液中蛋白质质量后，推算所取4 mL菌液蛋白质质量。另外1份离心，冷冻干燥至恒重，称量样品离心管前后质量差得菌体干重。两份数据求得菌体内蛋白质含量。

1.2.4 NaCl浓度对菌株胞内可溶性糖含量的影响

1.2.4.1 绘制标准曲线

菌体内可溶性糖含量的测定及标准曲线的绘制参照蒽酮-硫酸法[12]。

1.2.4.2 样品中可溶性糖的提取及含量测定

将菌株接种于不同盐度(0%、2%、4%、6%、8%和10%)的LB液体培养基中，培养24 h后取4 mL菌液两份，离心取菌体，用NaCl等渗溶液冲洗3次。一份冷冻干燥至恒重测菌体干重。另一份加入蒸馏水4 mL，沸水浴15 min，冷却至室温后取1 mL测定可溶性糖含量及620 nm处吸光度。代入标准曲线的方程，计算1 mL提取液中可溶性糖含量后，推算所取4 mL菌液可溶性糖含量。两份数据求得菌体内可溶性糖含量。

1.2.5 NaCl浓度对菌株细胞膜相对通透性的影响

利用电导率法[13]来反映菌株细胞膜通透性情况。将菌株接种至不同盐度(0%、2%、4%、6%、8%和10%)的LB液体培养基中培养24 h后，分别取菌液10 mL，于7000 r·min-1离心10 min。收集菌体用无菌蒸馏水冲洗3次，加入蒸馏水20 mL，摇匀后静置30 min，利用电导仪测定电导率，记作L0。随后放入水浴锅中加热煮沸15 min完全破坏菌株细胞使其细胞膜功能损坏，通透性变为最大，冷却至室温测定电导率，记作L1。利用公式(1)计算细胞膜相对通透性。

(1)

1.3 菌株的耐盐机理

菌株可以利用以氨基酸为代表的相容性溶质来平衡细胞内外渗透压，从而维持细胞正常生命活动，生物在合成或获取相容性物质是其抵御外界高盐环境的主要机制[14]。革兰氏阴性菌(G-)可积累谷氨酸，G+菌可积累脯氨酸作为调渗物质，提高菌株的耐盐性能。另外有研究表明菌株也可以通过积累甜菜碱、海藻糖以提升其耐盐性[15]。

本试验选用脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、海藻糖、甜菜碱作为外加相容性溶质，添加量为1 g·L-1，每一种物质对应配制不同盐度(0%、2%、4%、6%、8%和10%)的培养基。接种1 mL菌液，于35℃，120 r·min-1摇床培养24 h后测定菌液的OD600值。

2 结果与讨论

2.1 菌株的耐盐特性

2.1.1 不同NaCl浓度对菌株生长的影响

菌株对盐的耐受程度取决于盐度和菌种类型，在不同盐度的培养环境中，相同菌株的生长速率存在差别。NY1在不同NaCl浓度环境中的生长情况如图1所示。

在0%～10%盐度条件下菌株均能生长。在盐度为0%和2%条件下，菌株停滞期较短，停滞大约4 h左右。当盐度为0%时，菌株生长速率最快，大约12 h进入生长稳定期。当盐度为2%时菌株在16 h时进入生长稳定期，到第31 h时OD600值为1.864，高于其余5个盐度条件下的生物量。之后随着盐度的不断增加，菌株生长逐渐受到抑制，停滞期逐渐加长。在盐度为4%条件下菌株生长停滞6 h，在盐度为6%、8%和10%条件下停滞期超过12 h，由图1可以看出，盐度为6%、8%和10%条件下的12 h之内菌株几乎不生长，生物量几乎为零，在盐度为6%、8%和10%条件下,菌株的最终生物量分别为1.542、1.1和0.47，可见随着盐度的增加，菌株生长受到的抑制作用也逐渐增强。这是由于菌株进入高盐环境后，外界高渗透压对细胞造成压迫，此时细菌需要启动自身调节机制以适应外界环境。例如尽快增加壁厚，向细胞壁积累糖类或者通过从外界吸收K+，开启排Na+泵等活动降低高盐环境的压迫，在这种情况下菌株的其它生命活动例如增长繁殖将会受到抑制[16]。

2.1.2 不同盐分对菌株生长的影响

实际印染废水中成分复杂，含有各种盐类物质，要运用到实践中的耐盐菌不能只耐受一种盐类物质。所以为探究NY1对不同盐类物质的耐受情况，分别配制了含有不同盐类物质的培养基，观察菌株在其中的生长情况。不同盐分对菌株生长的影响如图2所示。

菌株NY1在含有NaNO3、Na2SO4、Na2SO3的培养基中与在NaCl培养基中的生长量相差不大，说明NY1也能耐受这3种钠盐。然而NY1在含有NaNO2和NaHCO3的培养基中OD600值仅为为0.144和0.028，可见这两种盐对菌株的生长有着明显的抑制作用。在含有KCl和MgCl2的培养基中，菌株OD600分别为1.456和1.509，均高于在含有NaCl的培养基中生长量，说明KCl和MgCl2能有效促进菌株的生长。其中菌株在含有MgCl2的培养基中的生长量是NaCl培养基中的1.12倍，说明Mg2+有利于增加菌株耐盐性，这可能是因为Mg2+能促进碳源分解，是酶的重要激活剂，能够对细胞有氧氧化活动起作用。由此可知NY1除了可以耐受NaCl盐环境，对另外6种盐也有耐受性，具有应对含有复杂盐分废水的潜力。

2.1.3 NaCl浓度对菌株胞内蛋白质含量的影响

2.1.3.1 蛋白质标准曲线

在595 nm下利用紫外分光光度计测量标准蛋白样品，所得标准曲线如图3所示，得到线性方程为：y=7.3243x+0.009，R2=0.9991。

2.1.3.2 菌株胞内蛋白质含量

不同NaCl浓度培养基中菌株胞内蛋白质含量如图4所示。

在试验盐度范围内，NY1菌株细胞内蛋白质含量与盐度成正相关。当盐度为0%时NY1蛋白质含量为50.66 mg·g-1dry cell，当盐度升高至6%和8%时蛋白质含量分别增加到57.85 mg·g-1dry cell和63.71 mg·g-1dry cell。随着盐浓度的升高，NY1胞内蛋白质总量增加，胞内累积蛋白质用以抵抗高盐环境。菌株大部分胞内活动通过酶来调节，蛋白质是酶的主要组成物质。蛋白质会出现在细胞质和细胞膜中，还会参与细胞内物质运输和合成，菌株调渗蛋白、通道蛋白等的增加来保证细胞在高盐渗透压下的正常生理活动[17]。

2.1.4 NaCl浓度对菌株胞内可溶性糖含量的影响

2.1.4.1 可溶性糖标准曲线

在620 nm下利用紫外分光光度计测量标准可溶性糖样品，所得标准曲线如图5所示，得到线性方程为： y=5.9243x+0.0013，R2=0.999。

2.1.4.2 菌株胞内可溶性糖含量

不同NaCl浓度培养基中菌株胞内可溶性糖含量如图6所示。

在试验盐度范围内，NY1菌株细胞内可溶性糖含量与盐度基本成正相关。当不含盐时可溶性糖含量为1.79 mg·g-1dry cell。当盐度增加至4%时，可溶性糖含量迅速增加。盐度由4%增加到10%，可溶性糖含量逐渐增加。当盐度为10%时可溶性糖含量为7.31 mg·g-1dry cell。随着盐浓度的升高，NY1胞内可溶性糖含量增加，但是相对于胞内蛋白质而言，可溶性糖含量较少，且增加速率较为缓慢。这可能是由于两方面的原因造成的，一方面由于胞内外渗透压平衡依靠细胞转运外界的蛋白质和自身合成蛋白质来实现。另一方面可溶性糖为菌株蛋白质、核酸的合成提供源源不断的燃料，在积累的过程中又不断被消耗，所以可溶性糖在菌株胞内的累积量少于蛋白质。

2.1.5 NaCl浓度对菌株细胞膜相对通透性的影响

相对通透性值能够反映菌株细胞膜的受损程度。不同盐度培养基中菌株细胞膜相对通透性变化如图7所示。

菌株NY1膜的相对通透性随着盐度的提升逐渐增大。在0%～8%盐度下，菌株细胞膜比较稳定，相对通透性上升幅度不大。当盐度由8%提高至10%，菌株受到高盐负荷冲击相对通透性显著增加，菌株NY1膜的相对通透性从20.85%增加至30.85%。菌株细胞膜功能正常时电导率相对稳定，但是在过高的盐度环境下菌株无法生长，这可能是由于过高盐度破坏的菌株的细胞结构导致细胞膜的通透性增大，胞内物质如阳离子、质子等流出，从而造成菌株死亡。

2.2 菌株的耐盐机理

探究在0%～10%盐度下，外加5种相容性溶质对菌株生长的影响如图8所示。

在盐度为0%～10%的培养基中NY1均能利用外加的五种相容性溶质，生物量比未加的多，外加的相容性溶质对菌株的生长均有不同程度的促进作用。当盐度为2%时利于NY1生长，未加相容性溶质的培养基与外加脯氨酸和谷氨酸的培养基中菌株的生物量均显著增加，说明此时的菌株可能通过积累脯氨酸和谷氨酸提高其耐盐性。当盐度为4%时，菌株NY1在外加甜菜碱的培养基中的生物量有所增加，邱凯旋[18]等人的研究发现，外源甜菜碱的添加刺激胞外多糖的合成提高了Rhodococcussp.HX-2的耐盐性。当盐度由4%提高至10%时，菌株的生物量均显著减少，其中菌株NY1在外加脯氨酸和海藻糖的培养基中生长最好，说明脯氨酸和海藻糖这两种相容性溶质的积累使得菌株能够抵御外界的高盐环境。另外有实验研究表明谷氨酸可作为革兰氏阴性菌的调渗物质，革兰氏阴性菌NY1在高浓度盐环境中可以利用谷氨酸提升其耐盐性能[19]。NY1细胞膜上可能存在特殊的转运蛋白，在高盐条件下可以从外界吸取并积累相容性溶质以维持渗透平衡。

3 结 论

菌株NY1在盐度为0%～8%的培养基中均能生长，而且2%的盐浓度能促进菌株的生长，此时的菌株生物量最高。除了NaCl外菌株还能利用NaNO3、Na2SO4、Na2SO3、KCl、MgCl2、CaCl2这几种盐类，说明该菌株有潜在的工业利用价值。菌株胞内的蛋白质和可溶性糖含量以及菌株的膜相对通透性均随着外界环境的盐浓度升高而增加。菌株NY1主要是通过积累相容性溶质从而抵御外界高盐环境，其中在盐度相对较高的条件下，脯氨酸和海藻糖能显著提高菌株的耐盐性能。以上结论为菌株NY1应用于高盐环境的生物修复提供基础理论依据。