阜新地区鹌鹑源主要病原菌分离、鉴定

刘耀川，龚商羽

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

鹌鹑作为野生鸟类，长期以来广泛分布于自然环境中。近年来随着人们生活水平不断提高，蛋用及肉用鹌鹑的饲养规模也逐渐扩大，而与之相关的细菌病的报道也随之增加，严重制约了鹌鹑规模化养殖的发展。由于野生鹌鹑在自然环境中具有较高的自由度，因此也成为病原的传播媒介。特别是在禽类养殖密度较高及人类生活区附近，极易造成病原快速传播，不仅威胁养殖业安全，同时也对公共卫生安全造成严重威胁。

本研究对阜新地区鹌鹑饲养场及自然环境中发现的急性死亡鹌鹑进行病原菌分离、鉴定，为该地区鹌鹑细菌病治疗、预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 样本来源 在阜新市某蛋用鹌鹑养殖场内，选取急性死亡鹌鹑（69只）及临床表现精神萎靡、食欲不振、羽毛松乱、缩头、排白色粪便的鹌鹑（155只）；同时收集在自然环境中发现的野生鹌鹑尸体14只。

1.1.2 主要仪器 解剖用手术器械、酒精灯、无菌棉拭子、5mL离心管、10mL离心管、高压立式蒸汽灭菌器（DOZ/CQ30L）、生物安全柜（AirBio 2680C）、立式电热恒温培养箱（HitPot 6079）、电热恒温振荡培养器（TZD-68C）、酒精灯、各量程微量移液器（Eppednorf）等，由阜新市动物疫病预防控制中心提供。

1.1.3 主要试剂 沙门氏菌生化鉴定管（11种×10支，J2201）、肠杆菌科细菌生化鉴定管（15种×10支，J2002）购于杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染色液试剂盒（HB8278）购于青岛海博科技公司；普通琼脂培养基、营养肉汤、S-S琼脂（Salmonella Shigella agar）、麦康凯琼脂购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集 对死亡鹌鹑尸体胸廓区域用碘酊-酒精消毒后，用手术剪沿胸廓正中线剪开暴露肝脏。将手术刀片用酒精灯灼烧后对肝脏组织表面烧烙，然后切取合适大小的肝脏组织块，存放于含有无菌生理盐水的离心管中，将离心管密封、标记后，置于4℃保温箱中，尽快送至实验室。

对患病鹌鹑，用无菌棉拭子采集其泄殖腔内容物。采集后将棉拭子头存放于含无菌生理盐水的离心管中，标记后置于4℃保温箱中送至实验室。

1.2.2 培养基配置 按照产品说明书要求，用无菌去离子水对NB、营养琼脂、麦康凯琼脂、S-S琼脂进行配置、分装。NB分装于5mL离心管中，营养琼脂、麦康凯琼脂、S-S琼脂分别制备成90mm的固体培养基。上述培养基均需在无菌生物安全柜中制备，密封后在37℃恒温培养箱中过夜培养，检菌合格后放于4℃冰箱中保存、备用。

1.2.3 病原菌扩增 在无菌生物安全柜中，用无菌眼科剪将死亡鹌鹑肝脏在存放的离心管中充分剪碎。在震荡混匀仪上对离心管充分震动、混匀，用同样的方法处理盛放泄殖腔棉拭子头的离心管。样品充分混匀后，取其中的生理盐水混匀液100μL接种于5mL的NB肉汤中。将NB肉汤置于恒温振荡培养箱中，37℃180rpm过夜培养。

取100μL过夜培养的NB肉汤，在无菌生物安全柜中用三角玻璃棒将其均匀涂布于普通营养琼脂上，正置片刻，待菌液完全吸收后，将琼脂培养基倒置于37℃恒温培养箱中，培养12h。观察培养的普通琼脂，选取大小不同的单独菌落，进行NB肉汤扩增。并将扩增后的菌液保存于终浓度为30%的甘油溶液中，于-80℃保存，待检。

1.2.4 病原菌分离 用接种针取保存的甘油菌，分别于麦康凯琼脂培养基和S-S琼脂培养基中进行划线培养。划线完毕后，将培养基倒置于37℃恒温培养箱中，需氧条件下培养18～24h。

1.2.5 革兰氏染色镜检 在麦康凯培养基中选取经典红色圆形、具有金属光泽的单独菌落；在S-S琼脂培养基中，选取无色、圆形、小菌落，进行NB纯化培养。用接种环分别挑取等量的生理盐水和细菌培养物，充分混合后，按革兰氏染色试剂盒说明书操作要求对病原菌进行染色、镜检，观察细菌染色结果与形态，对其进行初步鉴定。

1.2.6 生化反应鉴定 取初步鉴定的大肠杆菌分离株和沙门氏菌分离株，在无菌生物安全柜中，分别接种于肠杆菌科生化鉴定管和沙门氏菌生化鉴定管中。每个鉴定管在接种后应用1滴液体石蜡对反应面进行封闭处理，并用封口膜对鉴定管进行封口、标记后，将鉴定管放置于37℃恒温培养箱中过夜培养。培养后，根据反应管中颜色变化，对照编码手册对病原分离株进行赋码。最终根据赋码结果确定病原菌分离株的种类。

2 结果与分析

2.1 病原菌初步分离结果根据鉴别培养基生长特点，以及革兰氏染色、镜检观察，在麦康凯琼脂上见到呈现典型金属红色光泽、圆形小菌落，革兰氏染色镜检呈两端钝圆、散在、无芽孢的阴性短杆菌为大肠杆菌疑似株；在麦康凯琼脂呈现半透明、圆形隆起、灰白色小菌落，在S-S琼脂中呈现无色、圆形小菌落，革兰氏染色为阴性短杆菌、中等大小、两端钝圆，为沙门氏菌疑似株。

在83只死亡鹌鹑肝脏样本中，得到大肠杆菌疑似分离株42株、沙门氏菌疑似分离株33株；在155份泄殖腔棉拭子样本中，得到大肠杆菌疑似分离株92株、沙门氏菌疑似分离株66株。

2.2 病原菌生化鉴定结果对初步分离的疑似病原菌分离株进行生化反应鉴定，并根据编码结果进行病原菌种类确定，最终在134株大肠杆菌疑似株中确定大肠杆菌分离株71株；在99株沙门氏菌疑似株中确定沙门氏菌分离株36株。

根据不同样品来源对病原菌分离结果进行分析可知，在饲养场获得的224个样品中（69个尸体样本、155个泄殖腔棉拭子样本）共分离到大肠杆菌57株、沙门氏菌22株。其中69个尸体样本中大肠杆菌和沙门氏菌分别为27株和12株；155个棉拭子样本中大肠杆菌和沙门氏菌分别为30株和10株。在14个野生鹌鹑尸体中分离到大肠杆菌和沙门氏菌各14株。综合分析，本研究大肠杆菌和沙门氏菌的总体分离率分别为29.8%（71/238）和15.1%（36/238），占比分别为66.4%（71/107）和33.6%（36/107）。病原菌分离、鉴定具体结果见表1及图1。

表1 鹌鹑源病原菌分离、鉴定结果

3 讨论

大肠杆菌和沙门氏菌是禽类细菌病的主要病原，如能够引起鸡白痢、腹泻、禽大肠杆菌病等，对规模化禽类养殖威胁巨大。鹌鹑作为近年来新兴的集约化饲养禽类，因具有较高的经济附加值，其在畜牧养殖业中的地位逐渐提高。随着饲养规模不断壮大，鹌鹑细菌病的报道也逐渐增多，如李超等报道，扬州地区鹌鹑养殖场因沙门氏菌感染而造成大量死亡；夏维婕等对山东地区某鹌鹑养殖场调查发现，引起该场鹌鹑死亡的主要病原菌为大肠杆菌；张宗植等对延吉市某鹌鹑养殖场死亡病例研究发现，大肠杆菌和沙门氏菌混合感染是造成死亡的最主要致病菌；陈鑫等报道，南通地区鹌鹑饲养场送检的10只鹌鹑，沙门氏菌分离率为100%；杭柏林等报道，在河南新乡某鹌鹑养殖场死亡病例中，致病性大肠杆菌检出率为100%；李章程等对四川地区产蛋鹌鹑死亡病例检测结果表明，该场致病性大肠杆菌检出率为100%。本研究对阜新地区野生及饲养鹌鹑进行病原分离、鉴定，结果表明大肠杆菌和沙门氏菌为最主要致病菌，分离率分别为29.8%及15.1%。与报道数据相比分离率有一定差异，可能与地区性优势菌株差异有关。对自然环境中发现的野生鹌鹑尸体样本分析发现，野生鹌鹑的混合感染情况十分严重，在14只野生鹌鹑尸体中均发现大肠杆菌和沙门氏菌混合感染。对饲养场内获得的样本数据进行分析也可发现，在病死鹌鹑尸体获得的69份肝脏样本中，大肠杆菌和沙门氏菌的分离率分别为39.1%和17.4%，而在患病但未死亡的鹌鹑泄殖腔棉拭子样本中，上述分离率则为19.4%和6.5%，显著低于死亡病例中的分离率，推测2种病原菌在鹌鹑感染、患病直至死亡的整个过程中均扮演着重要角色。建议该鹌鹑养殖场根据研究结果，合理制定治疗方案及周围环境综合防控方案。