安五脂素对D-gal致衰老小鼠胸腺的保护作用及其相关机制①

李 欣 孙靖辉 王春梅 陈建光 敬 舒 李 贺 （北华大学药学院，吉林 132013）

衰老是生物体不可避免的自发现象，伴有组织和器官的逐渐退化。随着全球人口老龄化程度日趋增加，对抗衰老药物及保健食品的研究已成为热点［1］。关于衰老发生的机制，二十世纪六十年代，HARMAN 提出了自由基衰老学说，他认为当机体内产生自由基后，会对机体细胞和组织造成持续伤害，导致机体的衰老［2］。同期，美国病理学家WOLFORD［3-4］首次提出了免疫衰老的学说，该学说认为机体的衰老是由机体免疫功能的衰退导致的，即免疫系统从根本上决定了机体的衰老。在衰老动物模型方面，有研究表明，D-gal 诱导的衰老动物和自然衰老动物具有较多的相似特征，已被广泛应用于抗衰老相关药物的研究［5-7］。胸腺作为机体内重要的中枢免疫器官，其功能状态对机体的免疫功能有直接的影响，而D-gal 会使胸腺发生退行性变化，出现胸腺组织萎缩，功能减弱，免疫功能衰退，进而导致免疫衰老［8-11］。

传统中药华中五味子（schisandra sphenanthera rehd.et Wils）已作为可用于保健食品的中药，在抗氧化、保护肝脏损伤等方面具有诸多研究和应用［12-16］。安五脂素是华中五味子木脂素标志性单体化合物成分，然而，目前关于其功效的研究较少［17-19］。前期研究发现安五脂素对D-gal 诱导的衰老小鼠肝脏组织、脑组织和脾脏组织具有显著的保护作用，有很强的抗衰老作用，但其对胸腺组织的影响目前尚未见报道［20-22］。因此，本研究旨在明确安五脂素对衰老小鼠胸腺组织的保护作用，并探讨其可能的作用机制，为研究和开发抗衰老及改善免疫功能的药物和保健食品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性ICR小鼠，体质量（20.0±2.0）g，6~8 周龄，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（吉）：2017-0005。

1.1.2 试剂 安五脂素购自四川省成都普菲德生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯）购自山东潍坊力特复合材料有限公司；D-gal 购自美国Sigma 公司；IL-2 试剂盒和 IFN-γ 试剂盒购自上海酶联生物公司；SOD试剂盒和MDA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ECL 显色液购自碧云天生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药 将80 只健康ICR小鼠随机分为5组，空白对照组（灌胃羧甲基纤维素钠，生理盐水皮下注射，10 ml/kg），模型组（灌胃羧甲基纤维素钠，220 mg/kg D-gal 皮下注射，10 ml/kg）和安五脂素低、中、高剂量组（分别灌胃1、2和4 mg/kg安五脂素，并皮下注射 220 mg/kg D-gal，10 ml/kg），每组16 只，灌胃和皮下注射1 次/d，持续给药42 d。每天观察并记录各组小鼠的身体状况，每隔3 d 称1次体质量，并根据体质量调整给药剂量。

1.2.2 安五脂素对小鼠胸腺指数的影响 1.2.1所述的每组小鼠连续给药，42 d后称取体质量，在末次给药后30 min 后处死小鼠，取出胸腺组织，去除周围组织，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，称取胸腺组织重量并计算胸腺指数，根据以下公式：胸腺指数（%）=胸腺重量（mg）/体质量（g）×100%。

1.2.3 安五脂素对小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影响 1.2.1 所述的每组小鼠连续灌胃42 d，末次给药后30 min 后，取外周血标本，3 500 r/min 离心10 min，收集上清，通过ELISA 试剂盒检测小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 的含量。具体方法参照各试剂盒说明书。

1.2.4 安五脂素对小鼠胸腺组织病理学的影响按1.2.1所述的每组小鼠随机选取3只，同1.2.2方法取出胸腺组织，将其置于10%的中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，切成5~10 μm厚的切片。切片进行HE 染色，在光学显微镜下进行常规组织学检查。

1.2.5 安五脂素对小鼠胸腺组织中SOD 活力和MDA 含量的影响 按照1.2.2 所述方法分离出小鼠胸腺组织，将其用生理盐水制为10%的胸腺匀浆。通过WST-1（水溶性四氮唑）法检测SOD 活性，通过TBA（硫代巴比妥酸）法检测MDA 含量，具体方法参照各试剂盒说明书进行。

1.2.6 安五脂素对小鼠胸腺组织中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 及 Bax 蛋白表达的影响 每组小鼠末次给药30 min 后，按照1.2.2 所述方法分离出小鼠胸腺组织，按比例加入裂解液，冰上裂解1 h，高速离心（10 min，12 000 r/min），吸取上清液，测定胸腺组织蛋白浓度，以10%电泳凝胶电泳分离Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 和 Bax 蛋白。电转移 2 h至聚丙二氟乙烯膜，Tris 缓冲液（TBS-T）漂洗5 min，在含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h。室温孵育后弃去封闭液，分别加入一抗 Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、Caspeas3（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000），4 ℃温育过夜后，TBS-T洗5 次×5 min。加入二抗（1∶5 000）温育 2 h，TBS-T 洗5次×5 min，最后加入显色液ECL显色。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计分析。小鼠胸腺指数，血清中IL-2 和IFN-γ 含量，胸腺组织中的 SOD 活力、MDA 含量及 Western blot 的实验数据用表示，每组中的样本数用n表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 安五脂素对小鼠胸腺指数的影响 结果如图1所示，与CON 组相比，MOD 组小鼠胸腺指数明显降低（P＜0.01）；与MOD 组比较，安五脂素中剂量组和高剂量组小鼠胸腺指数显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。安五脂素各剂量组小鼠胸腺指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 安五脂素对小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影响 结果如图2 所示，与CON 组比较，MOD 组小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量显著减少（P＜0.01），给予安五脂素后各剂量组小鼠血清中IL-2 含量均显著升高（P＜0.01），IFN-γ 含量在安五脂素低剂量组和高剂量组显著升高（P＜0.05）。安五脂素各剂量组两两比较，IL-2 和IFN-γ 含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2 安五脂素对小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影响Fig.2 Effects of Anwulignan on serum IL-2 and IFN-γ contents in serum of mice

2.3 安五脂素对小鼠胸腺组织病理变化的影响为了评价安五脂素对胸腺组织形态学的影响，对各组小鼠胸腺进行HE 染色，并在光学显微镜下观察胸腺组织形态的变化。实验结果如图3 所示，在CON 组中，皮质髓质分界清晰，胸腺细胞密集分布，没有巨噬细胞，胸腺小体分散分布，大小不等，可见少数胸腺上皮细胞；MOD 组小鼠的胸腺皮质颜色淡染，胸腺细胞数目减少，且在皮质深层可观察到巨噬细胞吞噬正常胸腺细胞，髓质中胸腺小体数目减少；安五脂素低剂量组与MOD 组相比，胸腺细胞和胸腺小体数目明显增多，且吞噬现象得到明显缓解；安五脂素中剂量组与MOD 组相比，上述现象有一定程度的缓解，但效果不如安五脂素低剂量组明显；安五脂素高剂量组与MOD 组相比，胸腺细胞和胸腺小体数目减少，吞噬现象缓解，胸腺上皮细胞增生。

图3 安五脂素对小鼠胸腺组织病理学改变的影响（×200）Fig.3 Effects of Anwulignan on histopathology changes in thymus tissue of mice（×200）

2.4 安五脂素对小鼠胸腺组织中SOD 活力及MDA含量的影响 结果如图4 所示，与CON 组相比，MOD 组小鼠胸腺组织中SOD 活力显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.01）。给予安五脂素后，中剂量组和高剂量组胸腺组织中SOD 活力显著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 含量显著降低（P＜0.01）。安五脂素三个剂量组组间比较显示：高剂量组胸腺中MDA含量与低剂量组相比显著降低（P＜0.01），其他安五脂素剂量组对SOD 活力的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 安五脂素对小鼠胸腺组织中SOD活力和MDA含量的影响Fig.4 Effects of anwulignan on activity of SOD and content of MDA in thymus tissue of mice

2.5 安五脂素对小鼠胸腺组织中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2和Bax蛋白表达的影响 本研究应用Western blot 方法对各组小鼠胸腺组织的相关蛋白表达进行观察。结果如图5A、C，与CON 组比较，MOD 组Nrf2 和HO-1 的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），Keap1 的蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；给予安五脂素后，各剂量组Nrf2、HO-1 的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），Keap1的蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与安五脂素低剂量组相比，安五脂素中剂量组胸腺中Nrf2、HO-1和Caspase3 的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；安五脂素高剂量组胸腺中Nrf2 的表达水平差异有统计学意义（P＜0.01）。安五脂素中剂量组及高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 安五脂素对小鼠胸腺组织中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3，Bcl2和Bax蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Anwulignan on Keap1，Nrf2，HO-1，Caspase3，Bcl2，and Bax protein of mice

如图 5B、D 所示，与 CON 组比较，MOD 组 Bax 和Caspase3 的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），Bcl2 的蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。给予安五脂素后，各剂量组Caspase3 的蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bax 在安五脂素低剂量组和中剂量组的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而Bcl-2 在安五脂素中剂量组和高剂量组的蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与安五脂素中剂量组相比，安五脂素高剂量组小鼠胸腺中Bcl2和Caspase3的表达水平差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；安五脂素低剂量组胸腺中Caspase3蛋白表达水平差异有统计学意义（P＜0.01）。其余安五脂素给药组两两比较对上述指标的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

近年来，现代医学通过从大体结构到微观结构，从整体到细胞甚至基因对衰老的发生机理进行了一系列研究，已形成了多种理论学说，其中衰老的自由基学说和免疫衰老学说是衰老过程中具有代表性的学说［23-24］。自由基衰老学说认为自由基是引起氧化应激的重要因素，大量的自由基在体内的积累破坏了机体器官的结构和功能，造成了机体的损伤和衰老［25］。免疫衰老学说认为随着衰老的发展，胸腺等免疫器官逐渐萎缩，免疫细胞发生退化性改变，导致免疫功能减退，免疫相关疾病发病率增多［1，22］。D-gal 是一种还原性糖，是构建衰老模型的经典方法。过量的D-gal会导致机体自由基增多，引起氧化应激反应，从而造成与自然衰老相似的机体损伤，包括胸腺等免疫器官在内的机体多个器官的损伤［26-28］。本研究连续皮下注射D-gal 后，小鼠胸腺指数显著降低，胸腺结构受到损伤，这与既往研究报道一致［29-32］。而预防性给予安五脂素后，D-gal诱导的衰老小鼠胸腺萎缩及胸腺结构损伤被显著改善，具有显著的胸腺保护功能。IL-2 和IFN-γ 是由活化的淋巴细胞产生的细胞因子，体现出辅助性T 细胞的主要生物学效应，是机体重要的免疫功能指标［33-34］。在免疫衰老中，以T 细胞功能受损最为明显，IL-2 和IFN-γ 随年龄的增长产生减少，目前被认为是免疫老化的主要分子基础［35-36］。本研究结果显示，在给予安五脂素后，小鼠血清中IL-2 和IFN-γ含量增多，提示安五脂素可能通过调节小鼠体内IL-2和IFN-γ的水平，进而改善其免疫功能。

SOD 是机体最主要的抗氧化酶，在生物氧化过程中能够有效地清除自由基［37-39］。MDA是脂质过氧化的产物，是反应自由基所致的机体损伤的重要指标，其含量随着机体的衰老程度而升高［40-41］。本研究前期工作发现，安五脂素能够明显提高D-gal诱导衰老小鼠血清、肝脏组织、脑组织和脾脏组织中SOD活性，降低MDA的含量［20-22］。本实验对D-gal处理小鼠胸腺组织的检测结果与上述结果完全一致，进一步证实安五脂素在D-gal 诱导衰老小鼠中表现出显著的抗氧化作用，该作用可能是安五脂素保护胸腺损伤的主要原因之一。

Nrf2/ARE 通路是最为重要的内源性抗氧化应激调节通路，当细胞损伤时，Nrf2上调并激活下游抗氧化酶，增强细胞对氧化应激的耐受能力［42-44］。研究表明，通过调节体内Nrf2 的活性，可有效对抗氧化应激损伤，进而减轻机体免疫器官损伤［45-46］。Keap1 是Nrf2 负调控因子，HO-1 是体内较强的抗氧化剂，受 Nrf2 的调控［47］。本研究结果显示，经 D-gal处理后，小鼠胸腺组织Keap1表达水平显著升高，而Nrf2 及HO-1 表达水平显著降低。而给予安五脂素能够下调D-gal 处理的衰老小鼠胸腺组织中Keap1蛋白的表达水平，而上调Nrf2，HO-1 蛋白的表达水平，提示安五脂素可能通过激活Nrf2/ARE 信号通路而发挥抗氧化作用，进而改善D-gal对小鼠胸腺组织的损伤。

大量氧自由基可以通过脂质过氧化、蛋白质及酶变性和DNA 损伤等途径导致细胞凋亡，而组织细胞凋亡是机体衰老的主要特征之一［48-49］。免疫细胞凋亡与免疫系统的调节密切相关，是评价免疫功能变化的重要指标［50］。作为细胞凋亡的重要调节因子，以Bcl2 为代表的抗凋亡蛋白以及以Bax 为代表的促凋亡蛋白的表达水平高低决定细胞凋亡发生的走向［51-53］。研究表明，凋亡最终由Caspase 家族完成，而Caspase3 处于Caspase 级联反应的中心位置，是最重要的细胞凋亡调控蛋白［54］。有研究表明，Nrf2 可以通过与Bcl2 基因相关反应元件结合，调控Bcl2 表达和细胞凋亡过程。而通过使用Nrf2 抑制剂，可以使Bcl2 表达减少，Bax 表达增加，促进凋亡的发生［55-56］。本研究结果显示，D-gal 处理后，小鼠胸腺组织Bax 及Caspase3 表达水平显著升高，而Bcl2 表达水平显著降低。给予安五脂素能够上调D-gal 处理小鼠胸腺组织中Bcl2 的表达水平，下调Bax 及Caspase3 的表达水平，提示安五脂素可能通过抑制D-gal 处理小鼠胸腺组织的细胞凋亡进而发挥相关的保护作用，该抗凋亡作用可能与安五脂素激活Nrf2，进而调控Bcl2 的表达有关，其相关机制将在后续研究中进行深入探讨。

本研究选择1、2及4 mg/kg 3个剂量观察安五脂素对D-gal 处理小鼠胸腺损伤的保护作用。结果显示，高剂量组安五脂素对各检测指标的影响差异均具有统计学意义。通过3 个剂量组组间比较，不同剂量组小鼠胸腺 MDA 含量、Nrf2、HO-1 及 Bcl2、Caspase3表达水平差异有统计学意义。提示安五脂素对D-gal 诱导小鼠胸腺损伤的保护作用可能与剂量大小有关。但值得注意的是，安五脂素对小鼠胸腺指数、IL-2 和 IFN-γ 含量、SOD 活力等指标的影响在3 个剂量组组间比较时差异无统计学意义，这可能由于安五脂素针对不同指标的剂量效应关系不同所致，也可能与实验本身的灵敏度不同有关，其具体的剂量效应关系及相关机制尚需进一步深入探讨。

综上，本研究证实了安五脂素对D-gal致衰老小鼠的胸腺组织具有保护作用，该作用可能与安五脂素激活Nrf2/ARE 通路，进而在衰老小鼠胸腺组织中发挥的抗氧化及抗凋亡作用有关。