IL-37 通过调控LINC01554/miR-223-3p 轴抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭

韩森吉 李 媛 李 振 王 毅② （山东省淄博市第一医院产科，淄博 255200）

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，严重威胁女性生命健康。由于卵巢体积较小，且卵巢癌发病时缺乏典型症状，早期难以发现，多数患者确诊时已处于中晚期［1］。因此，深入探究卵巢癌发生发展的机制并寻找早期生物标志物和分子治疗靶点尤为重要。研究表明，炎症性微环境在肿瘤发生发展中起重要作用［2］。IL-37 是 IL-1 家族中的抗炎因子，是先天免疫应答和获得性免疫应答的抑制剂。近年IL-37 的抗肿瘤活性逐渐被发现。研究显示，IL-37 可抑制肝细胞癌、宫颈癌等肿瘤细胞增殖和迁移等恶性表型［3-4］。但IL-37 对卵巢癌发生发展的作用尚未阐明。

LINC01554 属于长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），其在肝细胞癌中表达降低，过表达LINC01554 可抑制肝细胞癌细胞生长、集落形成和体内肿瘤形成，为肝细胞癌治疗提供了新的分子靶点［5］。但LINC01554 对卵巢癌细胞恶性表型的影响及调控机制尚未阐明。lncRNA 可作为竞争性内源性RNA 与miRNA 靶向结合，调控miRNA 靶基因表达，从而发挥生物学功能［6］。LncBase v.2 生物信息学软件预测显示，LINC01554 可能靶向结合miR-223-3p。有报道称miR-223-3p在卵巢癌组织中表达上调，过表达miR-223-3p 可靶向抑制SOX11 表达促进体外卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭及体内肿瘤生长，miR-223-3p 可能是卵巢癌治疗的潜在分子靶点［7］。因此，本研究以卵巢癌细胞Caov-3 为研究对象，以LINC01554/miR-223-3p 轴为切入点，观察了IL-37 对Caov-3 细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源 取 2017 年 10 月至 2019 年 5 月于山东省淄博市第一医院行手术治疗的33 例卵巢癌患者的卵巢癌组织及癌旁正常组织，平均年龄（53.26±7.58）岁。纳入标准：①首次确诊；②术前未接受放疗、化疗等治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②合并高血压、糖尿病等慢性病患者；③合并血液系统疾病患者。本研究经山东省淄博市第一医院医学伦理委员会批准（201709-0206），患者知情同意。

1.1.2 细胞和试剂 卵巢癌细胞株Caov-3（中国科学院上海细胞库）；IL-37（美国Sigma 公司）；胎牛血清（FBS，美国 Hycolne 公司）；RPMI1640 培养基、CCK-8 试剂盒（北京索莱宝）；Trizol 试剂和Lipo‑fectamineTM2000 试剂盒（美国Invitrogen 公司）；PCR引物、LINC01554 过表达载体（pcDNA-LINC01554，5'-ATGTCATCGTGCGCGACACG-3'）、空载体（pcDNA，5'-CTGCGCGATATTCGTCTACG-3'）、LINC01554 小干扰RNA（si-LINC01554，5'-CGGAATTCATATCGC‑TACG-3'）、乱序无意义阴性序列（si-NC，5'-CGG‑TATGCCGATAGCGTAC-3'）、miR-223-3p 模 拟 物（mimics，5'-GUUAGGCUCGAUGUCUAUG-3'）、模拟对 照 序 列（miR-NC，5'-GCUCGUUAUAGCGUUA‑CUC-3'）由上海生工生物工程有限公司提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒、双荧光素酶活性检测试剂盒（上海碧云天）；神经型钙黏蛋白（N-cad‑herin）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）和 GAPDH 抗体（武汉博士德）；逆转录试剂盒、PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 检测组织中LINC01554 和miR-223-3p 表达 在液氮保护下，研磨收集的卵巢癌组织和癌旁正常组织，加入Trizol 试剂提取总RNA，逆转录为 cDNA，行 PCR 反应。PCR 反应条件：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 个循环。引物序列：LINC01554 正向引物5'-TGTG‑GCAAACGCAAACGA-3'，反向引物 5'-GCCCAGAG‑TAAAGGGAAATGTA-3'；miR-223-3p 正 向 引 物 5'-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3'，反向引物 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；GAPDH 正向引物5'-TG‑GTATCGTGGAAGGACT-3'，反向引物5'-AGTAGA-GGCAGGGATGATG-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTC‑GGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2−ΔΔCt计算 LINC01554 和 miR-223-3p相对表达，其中LINC01554 以GAPDH 为内参，miR-223-3p以U6为内参。

1.2.2 细胞培养和转染 采用含10%FBS 的RPMI1640 培养基培养Caov-3 细胞，当细胞生长至80%左右密度时0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3 比例传代培养。将对数生长期Caov-3细胞以5×105个/孔接种于6孔板，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书 分 别 转 染 pcDNA、pcDNA-LINC01554、si-NC、si-LINC01554、miR-NC、miR-223-3p mimics 6 h，更换培养基，培养24 h 后RT-qPCR 检测细胞LINC01554或miR-223-3p 表达验证转染效率，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞分组处理 未转染的Caov-3 细胞分为不同剂量IL-37 组，分别采用含 0、10、50、100 ng/ml IL-37 的培养基培养 24 h［3］。转染 pcDNA、pcDNALINC01554 的Caov-3 细胞用常规培养基培养24 h，记为 pcDNA 组、pcDNA-LINC01554 组。转染 si-NC、si-LINC01554、miR-NC、miR-223-3p mimics 的Caov-3细胞均用含100 ng/ml IL-37 的培养基培养24 h，分别 记 为 IL-37+si-NC 组 、IL-37+si-LINC01554 组 、IL-37+miR-NC组和IL-37+miR-223-3p组。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖 将未转染、转染后的Caov-3 细胞均以 0.5×104个/孔接种于 96 孔板，按1.2.3 分组。培养 24 h 后加入 10 µl CCK-8 试剂孵育2 h，酶标仪检测450 nm处光密度（OD）值。

1.2.5 克隆形成实验 将未转染、转染后的Caov-3细胞均以500 个/皿接种于培养皿，按1.2.3 分组。培养2 周后，弃培养基，4%多聚甲醛固定25 min，0.1%结晶紫染色15 min，显微镜观察，统计超过50个细胞的集落。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移 将未转染、转染后的 Caov-3 细胞均以 5×104个/孔接种于 6 孔板，培养4 h，细胞贴壁后，用200µl 移液器枪头在培养板底部沿中轴划两条平行线。PBS 洗掉划痕间细胞，并测量划痕间距d，记为d0h。按1.2.3 分组，培养24 h 后再次测量细胞间间距d，记为d24h，计算划痕愈合率（%）=（d0h−d24h）/d0h×100%。

1.2.7 Transwell 检测细胞侵袭 将未转染、转染后的 Caov-3 细胞均以 5×105个/孔接种于 6 孔板，按1.2.2 分组。培养24 h 后，收集细胞，调整浓度为5×104个/ml 的细胞悬液。将 Transwell 小室置于24 孔板，上室铺设Matrigel 基质胶，自然晾干，加入100 µl 细胞悬液，下室加 500 µl 培养基。常规培养24 h，弃培养基。取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色15 min，显微镜观察，随机取5个视野拍照并计数。

1.2.8 Western blot 检测细胞 E-cadherin 和 N-cad‑herin 蛋白表达 将未转染、转染后的Caov-3 细胞均以5.0×105个/孔接种于6孔板，按1.2.3分组。培养24 h 后收集细胞，RIPA 试剂提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，行SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）和 GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，加入山羊抗兔二抗（1∶3 000）37 ℃孵育1 h，加入化学发光试剂避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH 为内参，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.9 双荧光素酶报告基因实验 将对数生长期Caov-3 细胞以 5×105个/孔接种于 6 孔板，参照 Lipo‑fectamineTM2000 试剂盒说明书分别共转染WTLINC01554 与 miR-NC 或 miR-223-3p mimics、MUTLINC01554 与 miR-NC 或 miR-223-3p mimics。转 染6 h后收集细胞并裂解，参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0 软件分析数据。符合正态分布的计量资料以表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。Pearson 相关性分析分析卵巢癌组织中LINC01554与miR-223-3p表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC01554 和miR-223-3p 在卵巢癌中的表达及相关系分析 卵巢癌组织中LINC01554表达低于癌旁正常组织（P<0.05），而miR-223-3p 表达高于癌旁组织（P<0.05）。Pearson相关性分析显示，卵巢癌组织中LINC01554 与miR-223-3p 表达呈负相关（r=−0.977 2，P<0.05，图1）。

图1 卵巢癌组织LINC01554和miR-223-3p表达及相关性Fig.1 Expressions and correlation of LINC01554 and miR-223-3p in ovarian cancer tissue

2.2 IL-37 对Caov-3 细胞增殖、迁移和侵袭的影响 Caov-3 细胞经 50、100 ng/ml IL-37 干预后，细胞中LINC01554 表达升高（P<0.05），而miR-223-3p 表达降低（P<0.05），细胞OD值和集落形成数降低（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05），侵袭细胞数减少（P<0.05），E-cadherin 蛋白表达升高（P<0.05），而N-cadherin蛋白表达降低（P<0.05，图2、表1）。

表1 IL-37对Caov-3细胞LINC01554和miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.1 Effect of IL-37 on expressions of LINC01554 and miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

表1 IL-37对Caov-3细胞LINC01554和miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.1 Effect of IL-37 on expressions of LINC01554 and miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37 0 ng/ml group，1）P<0.05；compared with IL-37 10 ng/ml group，2）P<0.05；compared with IL-37 50 ng/ml group，3）P<0.05.

Colony forming number 106.67±3.30 107.33±4.50 84.33±3.401）2）54.67±2.051）2）3）157.461 0.000 Groups IL-37 0 ng/ml IL-37 10 ng/ml IL-37 50 ng/ml IL-37 100 ng/ml F P LINC01554 1.00±0.00 1.03±0.04 1.67±0.061）2）3.62±0.191）2）3）441.511 0.000 miR-223-3p 1.00±0.00 0.97±0.03 0.56±0.061）2）0.12±0.011）2）3）446.326 0.000 OD value 1.17±0.08 1.18±0.08 0.94±0.071）2）0.64±0.041）2）3）40.057 0.000

图2 IL-37 对 Caov-3 细 胞 迁 移 、侵 袭 及 E-cadherin 和N-cadherin蛋白表达的影响Fig.2 Effect of IL-37 on migration and invasion and expressions of E-cadherin and N-cadherin proteins of Caov-3 cells

2.3 过表达LINC01554对Caov-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与pcDNA 组相比，pcDNA-LINC01554组 Caov-3 细胞 LINC01554 表达升高（P<0.05），而miR-223-3p 表达降低（P<0.05），细胞 OD 值和集落形成数降低（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05），侵袭细胞数减少（P<0.05），E-cadherin 蛋白表达升高（P<0.05），而N-cadherin 蛋白表达降低（P<0.05，图3、表2）。

表2 过表达 LINC01554 对 Caov-3 细胞 miR-223-3p 表达及增殖的影响（）Tab.2 Effect of overexpression of LINC01554 on expres⁃sion of miR-223-3p and proliferation of Caov-3 cells（）

表2 过表达 LINC01554 对 Caov-3 细胞 miR-223-3p 表达及增殖的影响（）Tab.2 Effect of overexpression of LINC01554 on expres⁃sion of miR-223-3p and proliferation of Caov-3 cells（）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

Groups pcDNA pcDNALINC01554 LINC01554 1.00±0.00 4.13±0.141）miR-223-3p 1.00±0.00 0.19±0.021）OD value 1.18±0.09 0.59±0.031）Colony forming number 106.33±4.78 45.67±2.051）20.201 0.000 t P 38.724 0.000 70.148 0.000 10.772 0.000

图3 过表达 LINC01554 对 Caov-3 细胞迁移、侵袭及E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响Fig.3 Effect of overexpression of LINC01554 on migra⁃tion and invasion and protein expressions of E-cad⁃herin and N-cadherin in Caov-3 cells

2.4 敲减LINC01554可减轻IL-37对Caov-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与IL-37+si-NC 组相比，IL-37+si-LINC01554 组 Caov-3 细 胞 LINC01554 表 达降低（P<0.05），而miR-223-3p 表达升高（P<0.05），细胞OD 值和集落形成数升高（P<0.05），划痕愈合率升高（P<0.05），侵袭细胞数增多（P<0.05），E-cadherin蛋白表达降低（P<0.05），而N-cadherin蛋白表达升高（P<0.05，图4、表3）。

表3 敲减LINC01554减轻IL-37对Caov-3细胞miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.3 Knockdown of LINC01554 reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

表3 敲减LINC01554减轻IL-37对Caov-3细胞miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.3 Knockdown of LINC01554 reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37+si-NC group，1）P<0.05.

Groups LINC01554miR-223-3p OD value IL-37+si-NC IL-37+si-LINC01554 3.53±0.24 1.17±0.071）0.11±0.01 0.82±0.071）0.65±0.04 1.08±0.091）Colony forming number 55.00±1.63 94.33±3.861）16.258 0.000 t P 16.351 0.000 17.391 0.000 7.562 0.002

图4 敲减LINC01554 减轻IL-37 对Caov-3 细胞迁移、侵袭及E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响Fig.4 Knockdown of LINC01554 reduces effects of IL-37 on migration and invasion and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in Caov-3 cells

2.5 LINC01554 靶向结合miR-223-3p LncBase v. 2 生物信息学软件预测显示，LINC01554 与miR-223-3p 的核苷酸序列存在连续结合位点（图5）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染WTLINC01554 与miR-223-3p mimics 的细胞荧光素酶活性低于共转染WT-LINC01554 与miR-NC 的细胞（0.15±0.01vs0.96±0.08，t=17.402，P<0.05），而共转染 MUT-LINC01554 与 miR-223-3p mimics 的细胞荧光素酶活性与共转染MUT-LINC01554 与miR-NC的细胞差异无统计学意义（0.95±0.07vs0.99±0.08，t=0.652，P=0.550），说明LINC01554可靶向结合miR-223-3p。

图5 LINC01554和miR-223-3p的互补序列Fig.5 Complementary sequences between LINC01554 and miR-223-3p

2.6 过表 达 miR-223-3p 减 弱 IL-37 对 Caov-3 细 胞增殖、迁移和侵袭的影响 与IL-37+miR-NC 组比较，IL-37+miR-223-3p 组 Caov-3 细胞 miR-223-3p 表达升高（P<0.05），细胞OD值和集落形成数升高（P<0.05），划痕愈合率升高（P<0.05），侵袭细胞数增多（P<0.05），E-cadherin 蛋白表达降低（P<0.05），而N-cadherin蛋白表达升高（P<0.05，图6、表4）。

图6 过表达miR-223-3p 减弱IL-37 对Caov-3 细胞迁移、侵袭及E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响Fig.6 Overexpression of miR-223-3p reduces effects of IL-37 on migration and invasion and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in Caov-3 cells

表4 过表达miR-223-3p 减弱IL-37 对Caov-3 细胞miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.4 Overexpression of miR-223-3p reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and prolifera⁃tion in Caov-3 cells（）

表4 过表达miR-223-3p 减弱IL-37 对Caov-3 细胞miR-223-3p表达及增殖的影响（）Tab.4 Overexpression of miR-223-3p reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and prolifera⁃tion in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37+miR-NC group，1）P<0.05.

Colony forming number 54.67±2.05 86.67±3.861）12.681 0.000 IL-37+miR-NC IL-37+miR-223-3p t P 0.12±0.01 0.76±0.051）21.740 0.000 0.64±0.05 0.90±0.061）5.766 0.004 Groups miR-223-3p OD value

3 讨论

近年研究发现，IL-37 具有抗肿瘤作用。IL-37可能通过下调p-STAT3 和MMP-2 表达抑制肝癌细胞 SMMC-7721 增殖、侵袭和迁移［8］；IL-37 可能通过抑制IL-6/STAT3 信号通路抑制食管癌细胞增殖、迁移及炎症反应［9］；高表达IL-37可抑制宫颈癌细胞增殖，并增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，其作用机制与下调 STAT3 和 CyclinD1 表达有关［10］。本研究显示，卵巢癌细胞经IL-37 干预后增殖、迁移和侵袭能力降低，提示IL-37 也发挥抗卵巢癌作用，但其机制还需深入探究。

肿瘤细胞迁移和侵袭是其复发和转移的主要原因，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭可有效降低肿瘤复发和转移的概率［11］。上皮-间质转化（epithelial-mes‑enchymal transformation，EMT）是细胞失去上皮极性而获得间质细胞特性的过程，此过程中上皮标志物E-cadherin 表达降低，而间质标志物N-cadherin 表达升高［12］。肿瘤细胞经历EMT 后，其骨架发生改变，细胞间黏附作用降低，易于迁移，形成转移灶［13］。本研究显示，IL-37 可促进卵巢癌细胞中E-cadherin蛋白表达而抑制N-cadherin 蛋白表达，提示IL-37 可能通过抑制卵巢癌细胞EMT抑制细胞迁移和侵袭。

lncRNA 和miRNA 是两类参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移等恶性表型的小分子非编码RNA，在卵巢癌发生发展中起重要作用［14］。LI 等［15］和DING 等［16］研究显示，LINC01554 在肝细胞癌中表达降低，与患者TNM 分期、肿瘤复发率及总生存期密切相关，过表达LINC01554 可抑制肝细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤细胞周期阻滞，是肝癌诊断和预后判断的生物标志物。本研究显示，过表达LINC01554 可减弱卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，提示LINC01554 也可作为卵巢癌靶向治疗的分子靶点。本研究还显示，IL-37可促进卵巢癌细胞LINC01554 表达，而敲减 LINC01554 则减弱 IL-37 对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示IL-37 可能通过上调LINC01554 表达抑制卵巢癌细胞恶性表型。

为进一步探究IL-37 可能通过上调LINC01554抑制卵巢癌细胞恶性表型的分子机制，本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实LINC01554可靶向结合miR-223-3p，且过表达LINC01554 促进卵巢癌细胞miR-223-3p 表达，说明LINC01554 靶向结合并负调控miR-223-3p。研究显示，miR-223-3p 在非小细胞肺癌、胃癌和肾细胞癌等肿瘤中表达上调，发挥促癌基因作用［17-19］。本研究显示，IL-37 可抑制卵巢癌细胞中miR-223-3p 表达，而过表达miR-223-3p 减轻IL-37 对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步提示IL-37可能通过靶向LINC01554进而抑制miR-223-3p表达影响卵巢癌细胞恶性表型。

综上，IL-37 可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与调控LINC01554/miR-223-3p轴有关。但本研究存在不足之处，仅通过体外单一细胞实验探究了IL-37 对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能机制，尚未进行裸鼠移植瘤实验在体内验证IL-37 对卵巢癌发生和转移的影响，且LINC01554/miR-223-3p轴下游靶基因和信号通路对卵巢癌发生发展的影响也未涉及，因此还需进一步探究。