12株腹泻病人粪便样本中弓形杆菌全基因组结果分析

董新燕，张玉兰，刘发强，王晓丽，徐保红，高伟利，郭玉梅

弓形杆菌属为革兰阴性、螺旋状、有运动性的细菌，属于变形菌纲，该属的细菌在环境中广泛存在，其中的几个种是新发的食源性人兽共患病原体，能够通过受污染的食物或水传播，引起人的急性肠炎等症状。弓形杆菌属(Arcobacter)自1991年从弯曲菌属中分离出来[1]，与弯曲菌属的细菌相比，弓形杆菌属的最适生长温度较低，生长的气体环境要求也更为宽松，其中，布氏弓形杆菌在需氧、厌氧、微需氧的气体环境下均能够生长[2-3]。截至2021年9月，原核生物标准命名列表(LPSN)中在弓形杆菌属下共收录32种，其中，布氏弓形杆菌(A.butzleri)、嗜低温弓形杆菌(A.cryaerophilus)、斯氏弓形杆菌(A.skirrowii)被认为是人兽共患的新发病原体，人一般通过进食受污染的生食或未煮熟的动物源性食物以及受污染的水而感染，可能引起急性和慢性肠胃炎和败血症等疾病[4]。

目前，弓形杆菌的致病机制尚不清晰，对其毒力基因的研究能够帮助阐释其致病机制，研究者Miller等2007年首次鉴定了布氏弓形杆菌(Arcobacterbutzleristrain RM4018)的毒力基因，其中，cadF(黏附蛋白)、cjl349(黏附蛋白)、ciaB(入侵蛋白)、mviN(肽聚糖合成蛋白)、pldA(磷脂酶A)和tlyA(溶血素蛋白)均是与弯曲杆菌属同源的毒力基因[5]。除此之外，irgA(铁调控外膜蛋白)、iroE(铁载体酯酶)、hecA(丝状血凝素)和hecB(溶血素激活蛋白)也是在布氏弓形杆菌中常见的毒力基因[6]。

本研究成功从腹泻病人粪便中分离了12株弓形杆菌并进行了全基因组测序，重点对12株弓形杆菌的毒力基因和耐药基因进行了分析，利用相关的生物信息学技术获得本次分离株的遗传特点。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 收集在2018—2019年在石家庄市两所哨点医院感染科就诊的急性腹泻患者粪便样本，患者要求有可疑饮食暴露史且有消化道症状，并排除病毒性、常见细菌性、化学性和脂肪性病例。病例定义是指由食品或者怀疑由食品引起的，以腹泻为主诉的就诊病例。腹泻次数要求≥3次/d，腹泻性状包括水样便、粘液便、稀便和脓血便。

1.1.2 仪器与试剂 三气培养箱(德国Binder)，MOLDI-TOF质谱仪(德国布鲁克)，弓形杆菌检测试剂盒(青岛中创汇科)、细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302-02)，引物合成及PCR相关试剂购自大连宝生物，测序由北京诺禾致源测序公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分离与基因组提取 取棉拭子蘸取少量粪便标本，放入弓形杆菌增菌液，37 ℃微需氧培养24 h，用0.45 μm滤膜过滤到至双孔板上，37 ℃微需氧培养48 h，挑选可疑菌落转至哥伦比亚血平板微需氧37 ℃培养48 h纯培养，用MALDI-TOF进行菌株鉴定。细菌基因组DNA提取采用Promega细菌基因组提取试剂盒，严格按照说明书操作。

1.2.2 全基因组全测序 Qubit进行定量，琼脂糖凝胶电泳检测合DNA 样品，条带前后沿比较清晰，没有拖尾现象的样品进行 Illumina NovaSeq PE150测序。

1.2.3 种鉴定 对全测序结果的种鉴定采用DDH(http://ggdc.dsmz.de/)的方法， 布氏弓形杆菌选择的参考株为GCA_003730245.1，嗜低温弓形杆菌选择的参考株为GCF_001572845.1。DDH 采纳Formula2结果，大于70%认为同种[7]。

1.2.4 耐药基因与毒力基因分析 使用CARD数据库提供的Resistance Gene Identifier (RGI)软件将目标物种的氨基酸序列与CARD数据库进行比对(RGI内置blastp，默认evalue≤1×10-30)，根据RGI的比对结果，统计注释到数据库的抗性基因信息。

VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)数据库是用于专门研究致病细菌、衣原体和支原体致病因子的数据库，除收录毒力基因的物种信息、基本特征描述外，还提供毒力基因功能和致病机制的详细描述，将氨基酸序列，与VFDB数据库进行比对，把目标物种的基因和其相对应的毒力因子功能注释信息结合起来，得到注释结果。

1.2.5 MLST与系统发育树构建 以组装好的菌株序列进行MLST分型，参考pubmlst(https://pubmlst.org/organisms)网站。使用snippy进行变异检测及一致性序列的输出，使用MEGAX构建进化树，方法为NJ，设定Bootstrap 1000，选择布氏弓形杆菌NC_017187.1作为参考株。

2 结 果

2.1 分离培养结果及临床特征 2018-2019年共收集429例腹泻病人粪便样本，经过分离培养共检出5株嗜低温弓形杆菌、7株布氏弓形杆菌，分离阳性率为3.03%(12/429)。弓形杆菌阳性病例均为成人，各症状比例为腹痛76.92%(10/13)、恶心46.15%(6/13)、呕吐46.15%(6/13)，粪便性状分别为粘液便7.69%(1/13)、水样便(3次/d)38.46%(5/13)、水样便(4～6次/d)30.77%(4/13)、水样便(>10次/d)15.38%(2/13)。

2.2 测序组装及种鉴定结果 截至2021年9月，NCBI中共收录51株布氏弓形杆菌的全基因组序列，除1株基因组长度1.59 Mb，GC 30.3%以外，其余GC含量为26.7%～27.3%，基因组长度2.07～2.47 Mb。收录嗜低温弓形杆菌30株，GC含量为27.0%～28.2%，基因组长度1.85～2.37 Mb。本次12株弓形杆菌中，5株为嗜低温弓形杆菌，7株为布氏弓形杆菌，基因组组装信息如表1所示，基因组长度与GC含量符合预期。

表1 12株弓形杆菌鉴定结果及组装信息Tab.1 Identification and assembly information for 12 strains of Arcobacter

2.3 毒力基因 VFDB数据库的注释结果显示12株弓形杆菌均包含LPS、鞭毛、荚膜、LOS (lipooligosaccharide)、黏附相关的MOMP (major outer membrane protein)等毒力因子。但目前VFDB并未收录弓形杆菌的毒力基因，因此参考文献中提到的10个弓形杆菌常见的毒力基因运用blastn进行同源性检测，以序列相似度作热图，检测结果如图1所示。5株嗜低温弓形杆菌和7株布氏弓形杆菌均含有毒力基因cadF、ciab、cj1349、mviN、pldA、tlyA，5株嗜低温弓形杆菌均不含有hecA、hecB、irgA和iroE基因，SJZAB-1不含有iroE基因，SJZAB-2不含有hecB基因。

2.4 耐药基因 12株弓形杆菌的耐药基因的注释结果显示，外排泵系统是其耐药机制预测中占比较大的一部分，外排泵能够通过主动外排将各种不同的有毒化合物移出细胞，例如抗生素、重金属、有机污染物等。外排泵耐药系统共分为5个家族，分别是MFS(major facilitator superfamily antibiotic efflux pump)、SMR(small multidrug resistance antibiotic efflux pump)、MATE(multidrug and toxic compound extrusion transporter)、ABC(ATP-binding cassette antibiotic efflux pump)、RND(resistance-nodulation-cell division antibiotic efflux pump)，而12株弓形杆菌耐药基因预测中RND、MFS和ABC占比较大，尤其以RND占比最多，主要的耐药基因为adeG、adeC、mdtF。5株布氏弓形杆菌与2株嗜低温弓形杆菌中包含耐药基因OXA-368，属于OXA-β内酰胺酶家族，该类耐药基因可能帮助细菌产生β内酰胺酶从而导致其对β内酰胺类药物耐药。

2.5 MLST分型 MLST分型参考pubmlst(https://pubmlst.org/organisms)网站，分型结果如表2所示，以全基因组SNP使用NJ法做系统发育树，进化树如图2所示。

表2 12株弓形杆菌MLST分型Tab.2 MLST of 12 strains of Arcobacter

3 讨 论

布氏弓形杆菌和嗜低温弓形杆菌均是人兽共患的新发病原体，本次分离到的布氏弓形杆菌除2株分别未含有iroE和hecB毒力基因外，其余5株均含有常见的10种毒力基因。cadF、ciaB、cj1349、mviN、pldA和tlyA是在禽肉中所分离到的布氏弓形杆菌常见的毒力基因[8]，毒力基因hecA、hecB、irgA则较为少见[8-9]。值得注意的是，研究者发现，布氏弓形杆菌的hecA基因具有高度变异性，因此在以PCR为实验手段的研究中可能会由于引物设计导致假阴性结果[10]。本次分离到的嗜低温弓形杆菌均不含hecA、hecB、irgA3个基因，这与其他研究者的研究结果一致[11]。hecA是丝状血凝素FHA(filamentous hemagglutinin)家族的一员，而hecB编码一种相关溶血素激活蛋白，FHA蛋白广泛分布于植物和动物病原体中，有助于细菌的附着和聚集，并参与表皮细胞的杀死[5]。霍乱弧菌的irgA基因编码一个铁调控的外膜蛋白，irgA同源物已被证实在致病性大肠杆菌感染尿路的发病机制中发挥作用[12-13]。

弓形杆菌对多种抗生素具有耐药性已在大量研究中被证实[14]，外排泵系统是本次分离的弓形杆菌中耐药机制预测中占比较大的一部分，RND、MFS和ABC占比较大，RND是革兰氏阴性菌耐多药的重要决定因素之一[15]，Mateus C等的研究发现，布氏弓形杆菌的外排系统RND在几种抗菌物质，如抗生素、胆盐和生物杀菌剂的排出中发挥作用，同时，RND在生物膜形成、在人血清中存活的能力和粘附肠细胞的过程中发挥着一定的作用[16]。但是RND相关基因的存在是否是弓形杆菌耐药产生的原因仍然需要进一步的实验证明。

目前国内针对弓形杆菌的研究较少，尤其是腹泻病人中弓形杆菌的分离率以及菌株特征方面的研究亟需进一步的补充，作为新发的人兽共患病原体，了解其本地的菌株分离率、耐药及毒力情况能够给防控提供理论支持。

利益冲突：无

引用本文格式：董新燕，张玉兰，刘发强，等. 12株腹泻病人粪便样本中弓形杆菌全基因组结果分析[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：698-702. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.098