云南省大理市啮齿动物携带冠状病毒和戊型肝炎病毒的调查

杨 字, 殷红敏，黄 皓，孔逸尘, 陈 利，张云智

冠状病毒(Coronavirus，CoV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，包括甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus，α-CoV)、乙型冠状病毒属(Betacoronavirus，β-CoV)、丙型冠状病毒属(Deltacoronavirus，δ-CoV)和丁型冠状病毒属(Gammacoronavirus，γ-CoV) 4个属[1]。CoV广泛感染各种动物及人，引发呼吸道和消化道疾病[2]。目前感染人的CoV有7种，分属于α-CoV和β-CoV，通常前者引起类似普通感冒的轻微症状，后者导致严重的呼吸道疾病，引发大流行[3]。早在1949年，啮齿动物携带的冠状病毒(Rodent-borne coronavirus，RCoV)在小家鼠(Musmusculus)中首先分离到，命名为鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)[4]，根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)目前分类，鼠冠状病毒(Murinecoronavirus)包括MHV、大鼠冠状病毒(Rat coronavirus)和鸟嘴海雀病毒(puffinosis virus)，属于β-CoV的Embecovirus亚属。目前β-CoV包含5种可以感染人的冠状病毒，在过去不到20年里，β-CoV中的严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)已经造成3次大暴发，引起人类严重的疾病。近年来，ICTV新增多个与啮齿动物有关的冠状病毒种，例如中国鼠冠状病毒HKU24(ChinaRattuscoronavirus HKU24)、鹿城褐家鼠冠状病毒(LuchengRnratcoronavirus)。多项研究发现中国云南、浙江和欧洲等地的啮齿动物携带CoV[5-7]。

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)是无包膜的单股正链RNA病毒，属于戊肝病毒目(Hepelivirales)、肝炎病毒科(Hepeviridae)。肝炎病毒科分为正戊型肝炎病毒属(Orthohepevirus)和鱼戊型肝炎病毒属(Piscihepevirus)。正戊型肝炎病毒属分为 A、B、C、D 4种。目前，A种包含8个基因型，主要感染人；C种分为4个亚型，主要感染鼠和雪貂；B和D种分别感染禽类和蝙蝠[8]。戊型肝炎病毒引起人的急性和慢性肝炎，称戊型肝炎(Hepatitis E，HE)，HE为自限性急性病毒肝炎，临床上大多表现为轻微发热，但孕妇和免疫低下人群易感，引发慢性肝炎，严重者造成流产、死亡[9]。2011年，啮齿动物携带的HEV全基因组首次在褐家鼠(Rattusnorvegicus)中获得[10]，随后在多个国家的褐家鼠、黄胸鼠(Rattustanezumi)等家鼠属(Rattus)啮齿动物中发现，2018年我们课题组在云南省高山姬鼠(Apodemuschevrieri)和黑腹绒鼠(Eothenomysmelanogaster)中发现啮齿动物携带的HEV新基因型[11]。

啮齿动物种类占哺乳动物的40%以上，是哺乳动物中的第一大类群，与人类关系密切相关[12]。啮齿动物携带多种病毒，是病毒的天然储存库[13]。大理市属于北亚热带高原季风气候，动植物繁多，仅记录的啮齿动物就有20多种[14]，是研究CoV和HEV的天然场所。CoV和HEV是重要的人兽共患病RNA病毒。本文对大理市4个乡镇啮齿动物携带的CoV和HEV感染现况进行了调查，并发现在啮齿动物中存在共感染(Co-infection)现象。

1 材料与方法

1.1 样本收集及物种鉴定 2020年8月至2021年8月在云南省大理市的银桥镇、大理镇、下关镇和凤仪镇4个乡镇，以油炸食物为诱饵，用夹夜法进行宿主动物调查。捕获的小型哺乳动物立即带回实验室，先形态学进行鉴定，同时利用PCR扩增肝组织DNA的线粒体细胞色素b(mt-Cytb)基因，进行分子鉴定。样本进行无菌解剖，收集心、肝、脾、肺、肠置于冻存管中，-80 ℃保存待检。

1.2 核酸提取 CoV检测采用肠道组织，HEV检测使用肝组织。无菌剪取约0.1 g组织样本放入GeneReady动物PIII粉碎管(遂真，中国)中，加入灭菌的500 μL磷酸缓冲液，再置于GeneReady Ultimate生物样本低温快速制备离心系统(遂真，中国)中进行研磨。核酸提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(TIANGEN，中国)，制备步骤按照说明书进行。

1.3 巢式RT-PCR 病毒RNA扩增采用巢式PCR，两轮PCR反应体系皆为25 μL。第1轮采用Fastking一步法RT-PCR试剂盒(TIANGEN，中国)，RNA模板3 μL，CoV和HEV退火温度分别为50.0 ℃和52.8 ℃，第2轮采用Green Taq Mix(Vazyme，中国)，第1轮产物模板1 μL，CoV和HEV退火温度分别为50.0 ℃和53.6 ℃。PCR引物由赛默飞世尔科技有限公司合成(表1)。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性的扩增产物送生工生物工程股份有限公司进行双向序列测定。若测序结果为重叠峰，将PCR产物纯化回收(OMEGA Bio-tek，美国)、T-A克隆(Promega，美国)，再送阳性克隆菌液测序。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer information

1.4 核苷酸序列分析及系统进化树构建 通过DNAstar Lasergene软件包进行序列拼接、剪切。利用NCBI在线BLAST工具进行相似性比对分析。从GenBank中下载相近序列，使用ClustalX2进行序列比对。系统进化树构建使用MEGA-X，选择最大似然法(Maximum Likelihood，ML)进行1 000次bootstrap重复，核苷酸替代模型选择最优模型，自展值大于70%为可靠进化分支。CoV和HEV进化树基于部分RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)基因，相应啮齿动物宿主进化树基于部分mt-Cytb基因。

1.5 统计分析 Excel建立数据库，应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，P<0.05认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 啮齿动物种类 在大理市4个乡镇的居民区共捕获啮齿动物76只，经鉴定属于5属6种，其中黄胸鼠占55.26%(42/76)、褐家鼠占35.53%(27/76)、高山姬鼠占3.95%(3/76)、大绒鼠(Eothenomysmiletus)占2.63%(2/76)、针毛鼠(Niviventerfulvescens)占1.32%(1/76)及锡金小鼠(Mus Pahari)占1.32%(1/76)，其中黄胸鼠和褐家鼠为优势种(表2)。

2.2 病毒感染率及共感染率 利用CoV和HEV巢式PCR对76只啮齿类动物筛查。CoV病毒总感染率为15.79%(12/76)，感染动物为褐家鼠和黄胸鼠，褐家鼠的CoV感染率高于黄胸鼠，感染率分别为40.74%(11/27)、2.38%(1/42)，其它啮齿动物中未检测到CoV；HEV总感染率为6.58%(5/76)，感染动物为褐家鼠和黄胸鼠，褐家鼠HEV感染率高于黄胸鼠，感染率分别为14.81%(4/27)、2.38%(1/42)，其它啮齿动物中未检测到HEV。在银桥镇捕获的2只褐家鼠中同时检测到CoV和HEV病毒，共感染率为7.41%(2/27)(表2)。

表2 云南省大理市啮齿动物携带CoV和HEV感染现状Tab.2 CoV and HEV infection in rodents in Dali City, Yunnan Province

2.3 同源性比对分析 基于CoV的RdRp片段434 bp核苷酸分析，11株来自褐家鼠毒株均为α-CoV(GenBank登录号：OL689209～OL689219)，相互之间的同源性为99.47%～100.00%，与来自中国福建黄毛鼠(Rattuslosea)RtRl/FJ2015株同源性最高，为99.73%～99.74%；1株来自黄胸鼠毒株为β-CoV(GenBank登录号：OL689208)，与来自中国云南板齿鼠(Bandicotaindica)Ruili66株同源性最高，为98.21%(表3)。基于HEV的RdRp片段340 bp核苷酸分析，5株来自褐家鼠毒株均为HEV-C(GenBank登录号：OL689220～OL689224)，相互之间的同源性为94.74%～100.00%，与来自中国香港病人pt5株(从1名肾移植患者且为乙肝病毒携带者的脑脊液中检测到)同源性最高，为95.87%～96.21%(表4)。

2.4 系统进化树分析 基于CoV和HEV 部分RdRp基因，本研究获得的片段序列与具有代表性的不同基因型毒株共同构建系统进化树。为比较啮齿动物携带的CoV和HEV与宿主的关系，以啮齿动物mt-Cytb基因序列构建进化树并与CoV和HEV的进化树形成共进化关系图，用以推断病毒与其宿主的进化关系。

本研究的12株CoV中，来自黄胸鼠的CoVDLfy4与其他11株亲缘关系较远，与Ruili66和RtRn/YN2013形成1个分支，属于β-CoV的Embecovirus亚属。鼠冠状病毒代表株MHV-3和中国鼠冠状病毒HKU24代表株Ruili-77、Lijiang-14、Lijiang-211、Ruili-888和Lijiang-99都包括在Embecovirus分支。其余11株为CoVDLyq20、CoVDLyq21、CoVDLyq22、CoVDLyq33、CoVDLyq34、CoVDLyq36、CoVDLfy53、CoVDLfy58、CoVDLfy62、CoVDLfy67和CoVDLfy70，它们亲缘关系相对较近，且都来自于褐家鼠，与Longquan-311、GCCDC5、RtRl/FJ2015和Ruian83形成1个分支，属于α-CoV的Luchacovirus亚属。Luchacovirus分支包含鹿城褐家鼠冠状病毒的代表株Longquan-311、Ruian83、Lijiang-71和Lijiang-27。Lijiang-71和Lijiang-27的宿主分别为大绒鼠和大耳姬鼠(Apodemuslatronum)，通过进化树发现Lijiang-71和Lijiang-27与来自褐家鼠的Longquan-311和Ruian83亲缘关系相对较远。从CoV病毒-宿主共进化树来看，不同属的CoV能够感染同一种啮齿动物，同一属的CoV可感染不同的啮齿动物宿主，这种进化模式有利于CoV发生基因重组，适应新的宿主(图1)。

系统进化树显示本研究获得的5株HEV亲缘关系较近，褐家鼠所携带的HEVDLyq21、HEVDLyq34、HEVDLyq35、HEVDLyq40和黄胸鼠所携带的HEVDLfy11与pt5形成1个分支，聚集于HEV的C1亚型。C1亚型中除pt5来自于人之外，HEV17/1683也来自于人。来自雪貂的SF4379和F63、来自高山姬鼠的Ac14、Ac86和Ac16以及来自黑腹绒鼠的Em67、Em55和Em40各自形成1个进化分支，分别为HEV的C2、C3和C4亚型。HEV-A的宿主更为广泛，包括猪、骆驼和人类。HEV病毒-宿主共进化树与CoV相比，啮齿动物携带的HEV与相应宿主遗传进化较为一致。仅有3株C1型HEV的宿主出现“交叉进化”现象(图2)。

表4 戊肝病毒部分RdRp核苷酸同源性比对Tab.4 Partial RdRp nucleotide homology alignment of HEV

3 讨 论

大理市位于云南省西部，处于山脉与高原的过渡地段，拥有苍山、洱海等自然景观和丰富的动植物资源，存在宿主动物的多样性。在大理市周边城市的动物中检测出多种病毒，包括汉坦病毒(Hantavirus)、温州病毒(Wenzhou virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、戊型肝炎病毒，甚至与SARS-CoV-2极为相似的RaTG13蝙蝠冠状病毒[18-19]，存在病毒的多样性。啮齿动物与人类关系密切，对啮齿类携带病毒的调查对于人兽共患病防治非常有必要。

本研究在大理市4个乡、镇居民区捕获的啮齿动物中以黄胸鼠和褐家鼠为主。我们在褐家鼠和黄胸鼠中检测到12株CoV和5株HEV。褐家鼠CoV和HEV的感染率均高于黄胸鼠。未在褐家鼠中检测到β-CoV，也未在黄胸鼠中检测到α-CoV，但由于2种鼠活动范围存在重叠，不排除α-CoV和β-CoV均能在这2种鼠中感染。CoV和HEV在褐家鼠的感染率高于以往研究，而在黄胸鼠中则相反[20-21]，可能与地理、季节变化或检测方法差异有关。这2种病毒是否能引起人的感染，而造成疾病的暴发流行，需要进行长期的监测和研究。

来自褐家鼠的11株α-CoV亲缘关系较近，均属于Luchacovirus亚属；来自黄胸鼠的1株β-CoV与鼠冠状病毒和中国鼠冠状病毒HKU24相近，属于Embecovirus亚属。2003年SARS-CoV、2012年MERS-CoV以及从2019年流行至今的SARS-CoV-2对人类造成巨大危害。CoV高突变性和频繁的重组事件，使其易于适应新的宿主，发生跨种传播[22]。CoV病毒-宿主共进化树表明，CoV与对应宿主共进化过程中，进化速率不同，同一物种的啮齿动物存在不同属CoV，同种CoV能够感染不同啮齿动物。另一项研究表明啮齿动物携带的α-CoV极大可能起源于同一祖先，啮齿动物与CoV之间存在长期的相互作用[23]。

本研究从褐家鼠和黄胸鼠获得的5株HEV属于C1亚型，他们相互之间的同源性较高，在系统进化树中与来自肾移植受者的pt5共同形成1个分支。一般认为感染人的HEV仅限于HEV-A，HEV-C的宿主绝大多数是啮齿动物。先前虽然有人类感染HEV-C的血清学证据，但还不足以证明HEV-C能够直接感染人类。近期多项研究在免疫低下人群中检测到HEV-C病原体，并且发现感染人类的HEV-C为不同种，表明HEV-C能够跨种传播[24-26]。人类健康受HEV-C的威胁越来越大，应警惕该病毒在人群传播，因此需加强对大理市啮齿动物及人群HEV的监测。HEV病毒-宿主共进化树显示两者进化较为一致，HEV与其宿主的进化速率较为同步。相比于CoV，HEV在进化过程中更为稳定，发生变异和基因重组频率相对较低。

病毒、细菌、立克次体、朊病毒和寄生虫等都能引起人兽共患病[27]。啮齿动物体内不仅存在多种病毒，也携带其他微生物[28]。啮齿动物作为病原体的储存库，在人兽共患病的传播、影响病毒感染力和毒性方面有着重要作用。本研究发现褐家鼠中同时存在CoV和HEV共感染现象，虽然啮齿动物中病毒共感染现象十分普遍，但也不能忽视共感染可能造成的影响作用，这有待于进一步的研究。

利益冲突：无

引用本文格式：杨字, 殷红敏，黄皓，等. 云南省大理市啮齿动物携带冠状病毒和戊型肝炎病毒的调查[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：685-692. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.096