组蛋白去乙酰化酶3参与调控Hippo信号通路

张 伉,冯 颖,林鑫华,戚 昀

(1.复旦大学 生命科学学院,上海 200438;2.温州医科大学眼视光学院附属眼视光医院,浙江温州 325027;3.温州医科大学 眼视光学和视觉科学国家重点实验室,浙江 温州 325027)

Hippo信号通路最早是通过果蝇的遗传学筛选发现的,后续在哺乳动物中进行的大量研究证实其具有高度保守性。

早期在果蝇的研究中发现Hippo信号通路通过调控细胞增殖和凋亡之间的平衡实现对器官大小的控制[1-4]。果蝇中Hippo信号通路上游为Hippo(Hpo)/Salvador(Sav)-Warts(Wts)/Mats蛋白激酶链[1-11],下游为转录效应因子Yorkie(Yki)和转录因子Scalloped(Sd)[12-16],上游激酶通过调节Yki的亚细胞定位来发挥作用。当信号分子激活Hpo-Sav复合体后,活化的Hpo-Sav复合体磷酸化Wts-Mats复合体,进而促使Yki的磷酸化[5-9]。磷酸化的Yki与细胞骨架蛋白14-3-3结合并滞留于细胞质中,最终经泛素化途径被降解[12,15,17];当Hippo信号通路关闭时,去磷酸化的Yki进入细胞核与转录因子Sd结合形成转录复合体,激活靶基因的表达[13-16]。典型的靶基因有细胞凋亡抑制因子Diap1、细胞周期蛋白Cyclin E和促进增殖抑制凋亡的microRNA bantam[3-4]。多项研究报道通路上游激酶Hpo、Wts的突变或者Yki的过表达均会引起细胞增殖和凋亡异常,造成果蝇眼睛、翅膀等器官的过度生长[3,5,7,9]。

哺乳动物Hippo信号通路由果蝇对应的同源蛋白组成,上游为级联激酶MST1/2/SAV1、LATS1/2/MOB1,下游为效应因子YAP/TAZ和转录因子TEAD1-4[16]。已有大量研究在小鼠肝脏、心脏等器官中验证了Hippo信号通路调控器官大小这一功能[17-23]。此外,Hippo信号通路对损伤后的组织再生也至关重要,其报道的功能包括调节肠损伤条件下的肠道再生,调节胚胎心脏以及损伤后的心脏再生等[19-21,24-27]。Hippo信号通路的失调和多种癌症密切相关,多个研究报道在小鼠多种组织中特异性敲除LATS1/2[28-29]、SAV1[24,30]、MST1/2[22,31-32]和MOB1[33]均可引起组织增生和癌症发生,因此其在体内受到严格的调控。

目前已知的Hippo信号通路的调控因子大多集中在上游级联激酶的调控层面,这些调控因子能够感知细胞极性、机械力、可溶性因子和应激信号等多种环境和生理信号,主要包括以下几类:(1)细胞顶端基底极性蛋白,如调控顶端 基底极性的Merlin(Mer)、Expanded(Ex)和Kibra蛋白,三者形成的复合物可以招募Hpo、Wts和Mats到顶端质膜进行磷酸化激活[34-37];(2)平面细胞极性蛋白,如建立平面细胞极性的关键分子Ft/Ds(Fat/Dachsous)蛋白异二聚体能够直接调控Wts的磷酸化状态,或者通过影响Ex的稳定性调控激酶活性[38-43];(3)G蛋白偶联受体,不同亚型的G蛋白偶联受体识别外界环境中不同的信号分子,进而激活或抑制细胞内的Hippo信号通路[44-46];(4)细胞骨架成分,如肌动蛋白微丝可通过Wts介导调控Yki的活性等[47-48]。

除了上游激酶受到的调控,下游转录效应因子Yki作为从细胞质向细胞核传递信号的关键分子,也受到磷酸化、泛素化等翻译后修饰的调控。例如,细胞质中Hippo信号通路上游Wts激酶对Yki的磷酸化修饰使Yki滞留在细胞质中从而抑制Yki的活性[12]。细胞核内CRL4蛋白质复合体能够泛素化降解Yki,而CDK7对Yki的磷酸化则抑制CRL4蛋白质复合体的招募,维持核内Yki的稳定[49]。此外,Yki还受到蛋白 蛋白相互作用的调控,如生长抑制因子Tgi可以直接与Yki竞争和Sd的结合,从而抑制Hippo信号通路靶基因的表达[50]。

组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)通过调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平参与基因转录的表观遗传调控。果蝇中共有5种HDAC,根据蛋白序列和结构分为3类:Ⅰ类HDAC包括HDAC1和HDAC3,Ⅱ类HDAC包括HDAC4和HDAC6,Ⅲ类HDAC为Sirt2。其中仅有HDAC1和HDAC3具有转录调控功能。果蝇中缺失HDAC3会引起由促凋亡基因hid表达增加而导致的细胞凋亡[51]。在多种恶性肿瘤中,HDAC3都呈现出较高的表达水平,其抑制剂表现出抗肿瘤活性[52-54],但是HDAC3通过什么机制参与调控肿瘤的发生和发展仍有待研究。

在本文中,为了寻找Hippo信号通路新的调控因子,我们以过表达Yki造成果蝇眼睛过度增生的表型为基础,进行修饰因子筛选,鉴定出HDAC3能够特异性地靶向Hippo信号通路参与调控果蝇眼睛大小。

1 材料和方法

1.1 果蝇品系和质粒

果蝇品系GMR＞Yki,UAS-Dcr2/S-T、GMR＞Yki/CyO;UAS-Dcr2,Diap1-GFP/TM6B为作者杂交重组获得;果蝇品系GMR＞Yki、GMR＞InRCA和GMR＞Yki;Diap1-GFP均来源于美国得克萨斯大学西南医学中心蒋进教授实验室;果蝇品系hh＞ex-lacZ、GMR＞SdGA和质粒p UAST-Myc-Yki、p UAST-HA-Sd、3xSd2-Luc均来源于中科院生化细胞所张雷教授实验室,果蝇品系UAS-HDAC3RNAi购于清华大学果蝇中心,其他果蝇品系If/Cyo;UAS-Dcr2/Tm6B、If/Cyo;MKRS/TM6B、Da-Gal4(Ⅲ)、GMR-Gal4(Ⅱ)品系和质粒Renilla-Luc均源于本实验室。

1.2 果蝇S2细胞培养和转染

果蝇S2细胞在添加10%胎牛血清的Schneider培养基(Gibco)中培养,培养箱温度为25℃。使用HighGene Transfection reagent(ABclonal)对细胞进行转染。

1.3 免疫荧光染色

在1×PBS中解剖3龄幼虫,放入1 m L PBS溶液中;去上清,加入1 mL 4%PFA溶液,在室温条件下,摇床固定20 min;用PBST溶液清洗3次;加入100μL 5%FBS溶液,在室温条件下,摇床封闭15 min;去上清,加入100μL按一定比例配制的一抗,在4℃条件下,摇床孵育过夜;用PBST溶液清洗3次;加入100μL按1∶400(5%FBS)比例配制的二抗和适量DAPI,在室温避光条件下,摇床孵育1 h;用PBST溶液清洗3次;在载玻片中间滴加适量Vectashield mounting medium(Vector Laboratories),在显微镜下剥离幼虫成虫盘,放入Vectashield mounting medium中,封片;激光扫描共聚焦显微镜下观察。使用的抗体为:Rabbit anti-LacZ antibody(DSHB)、Rat anti-Cubitus interruptus(Ci)antibody(DSHB)。

1.4 RT-qPCR

向离心管中加入500μL TransZol up,放入3龄果蝇幼虫,充分研磨。使用TranZol Up Plus RNA Kit(TransGen)提取总RNA,使用All-in-One cDNA Synthesis Super Mix(Bimake)将RNA反转录为cDNA,使用2×SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake)进行实时荧光定量PCR,检测基因mRNA水平。引物序列为HDAC3(5′-CCTGGTAATGAACTACGGACTG-3′,5′-TTGCACAGAAGTCGAAGAGG-3′),rp49基因作 为内参。

1.5 RNA干扰

以果蝇cDNA为模板,合成dsDNA,引物序列为5′-TAATACGACTCACTATAGGGACCTTACGGACCGAGTGATG-3′,5′-TAATACGACTCACTATAGGGACCACCAATGTGGGTACGTT-3′。使 用MEGAscript T7 Transcription Kit(Thermo Fisher)将dsDNA体外转录为RNA,使用Direct-zolTMRNA MiniPrep(Zymo Research)纯化RNA,将纯化后的RNA在95℃孵育5 min,使RNA退火以形成双链dsRNA。GFP dsRNA作为对照。

1.6 双萤光素酶报告系统分析

向96孔板每孔中加入200μL已添加血清的Schneider培养基(Gibco),接种S2悬浮细胞,控制细胞密度为2×10/5m L;向孔中滴加1μg dsRNA,重复3次;2 d后,将p UAST-Myc-Yki、p UAST-HA-Sd、p Ac-Gal4、Renilla-Luc和3×Sd2-Luc质粒按照比例(共200 ng)加入到10μL Schneider培养基(Gibco)中,加入0.4μL转染试剂后,混合均匀,滴加到S2细胞中;转染60 h后,收集细胞,向细胞中加入适量5×Cell Lysis Buffer(Vazyme),吹打均匀,室温静置5 min使细胞裂解;吸取20μL细胞裂解液,使用Dual Luciferase Reporter Assay Kit(Vazyme)检测萤光素酶报告基因的活性。

1.7 统计学分析

利用Image J对果蝇成虫眼睛大小和3龄幼虫眼睛成虫盘免疫荧光强度进行定量测定。数据用均值±标准差表示。利用Graph Pad Prism进行统计学分析。检验计算P值,*表示P＜0.05,**表示P＜0.01,***表示P＜0.001。

2 结 果

2.1 敲除HDAC3抑制由过表达Yki引起的果蝇眼睛过度增生

为了发现和鉴定Hippo信号通路新的调控因子,我们在果蝇中进行了修饰因子筛选。筛选策略如下:利用在果蝇眼睛中特异性表达的GMR-Gal4驱动Yki过表达(GMR-Gal4,UAS-Yki,简称为GMR＞Yki),造成Hippo信号通路失调,引起果蝇眼睛过度增生(图1(a))。将此基因型的果蝇和RNAi品系的果蝇杂交,根据果蝇眼睛大小的变化,筛选能够增强或抑制组织增生表型的修饰因子。我们初步筛选了近3 000个不同的RNAi品系,发现与对照相比,敲低HDAC3能够抑制由过表达Yki引起的果蝇眼睛增生,使果蝇眼睛明显变小(图1(a,b))。同时,为了检测基因的敲降效率,我们利用在果蝇全身表达的Da-Gal4驱动UAS-HDAC3RNAi,发现HDAC3的m RNA水平显著降低(图1(c)),证明该HDAC3 RNAi品系能够有效地敲低HDAC3基因。

2.2 敲低HDAC3不影响其他信号通路

组织生长发育是一个复杂的过程,涉及到多个基因和信号通路,为了排除Hippo信号通路之外的非特异性因素的干扰,我们将GMR-Gal4的果蝇和UAS-HDAC3RNAi果蝇品系杂交,发现仅敲低HDAC3对眼睛大小没有影响(图2(a,b))。胰岛素受体信号通路也和组织生长发育相关,过表达持续性激活形式的胰岛素受体(GMR-Gal4,UAS-InRCA,简称为GMR＞InRCA)引起果蝇眼睛组织增生,敲低HDAC3同样不能够抑制此表型(图2(c,d)),说明HDAC3特异性地调控Hippo信号通路参与的组织生长发育过程。

图2 HDAC3特异性地影响Yki引起的组织增生Fig.2 HDAC3 specifically modulates eye tissue growth driven by Yki

2.3 HDAC3的缺失激活Hippo信号通路

接下来,为了探究HDAC3的缺失是否能够激活Hippo信号通路,我们在不同器官中敲低HDAC3,观察Hippo信号通路靶基因Diap1的表达变化。在眼睛成虫盘中,利用GMR-Gal4驱动Yki在形态沟(Morphogenetic Furrow,MF)的后部(P区)过表达,造成P区靶蛋白Diap1-GFP的表达显著升高(图3(a))。

图3 HDAC3在果蝇成虫盘调控Hippo信号通路靶基因的表达Fig.3 HDAC3 regulates Hippo target genes expression in Drosophila imaginal discs

在此背景下,敲低HDAC3使Diap1-GFP的表达水平显著降低(图3(a,b)),说明HDAC3的缺失激活了Hippo信号通路。

为了验证HDAC3对Hippo信号通路的调控作用,我们又在翅膀成虫盘中检测Diap1和另一个靶基因Ex的表达水平。将基因型为hh-Gal4的果蝇与UAS-HDAC3RNAi果蝇杂交,后代中hh-Gal4驱动UAS-HDAC3RNAi在翅膀成虫盘的P区表达,结果造成翅膀成虫盘发育严重缺陷(图3(c,d))。以上结果说明在果蝇眼睛和翅膀的发育过程中,HDAC3的缺失都能够激活Hippo信号通路,进而调控器官发育。

2.4 敲低HDAC3不能改变由过表达Sd引起的果蝇眼睛过度增生

Yki作为转录共激活因子,进入细胞核后需要与转录因子结合形成转录复合体才能发挥功能,果蝇中Yki结合的最典型的转录因子是Sd,为探究HDAC3的作用位点是否在Sd上游,我们进行了遗传学上位性实验。将基因型为GMR＞SdGA(GMR-Gal4,UAS-SdGA)的果蝇和UAS-HDAC3RNAi果蝇品系杂交,GMR-Gal4驱动眼睛中特异性表达持续激活形式的Sd,在此背景下敲低HDAC3不能改变由过表达Sd引起的眼睛过度增生(图4),说明HDAC3的作用位点可能在Sd上游,通过作用于Yki来发挥调控功能。

图4 敲低HDAC3不能改变过表达Sd引起的果蝇眼组织增生Fig.4 Knockdown of HDAC3 has no effect on overgrowth in eye tissue of Drosophila caused by overexpression of Sd

2.5 HDAC3失活抑制Sd-Yki转录复合体的转录活性

上述实验结果表明HDAC3可能作用于Yki,影响Yki和Sd的结合或者Sd-Yki复合体的转录活性。为了初步探究HDAC3对Sd-Yki复合体的调控作用,我们在果蝇S2细胞中进行了双萤光素酶报告系统分析。首先构建了靶向HDAC3的dsRNA,并对HDAC3dsRNA的RNAi效率进行了验证(图5(a),见第400页)。果蝇S2细胞经HDAC3dsRNA处理后,转染Myc-Yki质粒、HA-Sd质粒、Myc-Yki和HASd质粒以及3×Sd2-Luc报告基因质粒。3×Sd2-Luc报告基因质粒含有Sd靶基因dSRF的增强子序列,细胞中表达的有功能活性的Sd-Yki转录复合体可以结合到此增强子序列上,驱动下游萤光素酶报告基因的表达。结果表明,和转染对照质粒相比,单独表达Yki使Sd-Yki转录复合体的转录活性有轻微的上升,单独表达Sd或者共表达Yki和Sd使Sd-Yki转录复合体的转录活性大幅上升。在此背景下,失活HDAC3则显著抑制了Sd-Yki转录复合体的转录活性(图5(b),见第400页)。

图5 HDAC3失活抑制Sd-Yki转录复合体的转录活性Fig.5 Inactivation of HDAC3 suppresses the transcription activity of Sd-Yki complex

3 讨 论

21世纪初,Hippo信号通路作为抑制果蝇器官生长的机制被发现[1-2],随后的研究证实其在组织再生和癌症发生中也发挥关键作用[19-33]。长期以来,大量研究报道Hippo信号通路在体内受到多种调控因子的严格调控[34-48],但研究的内容主要侧重于通路上游,关于通路下游关键效应因子Yki的调控机制,尚未得到很好的解答。由于在不同的动物模型中突变或者过表达Yki,都可造成Hippo信号通路失调,引起器官大小的改变这一可被修饰的表型[12,18],已有研究以此表型为基础,在果蝇中通过靶向激酶和E3泛素连接酶的筛选发现和鉴定了Hippo信号通路中作用于Yki的调控因子[49,55]。因此,本研究旨在通过大规模的遗传学筛选,进一步探索Hippo信号通路下游的调控机制,加深对Hippo信号通路调控网络的认知。

我们基于“过表达Yki导致果蝇眼睛过度增生”这一表型进行修饰子筛选,获得了有明显抑制作用的修饰因子HDAC3。为了证明HDAC3对Hippo信号通路调控的特异性,我们又考察了HDAC3对其他组织生长发育相关信号通路的作用,发现敲低HDAC3并不能影响由胰岛素受体信号通路激活引起的眼睛过度增生表型。随后,我们通过Hippo信号通路靶基因的免疫荧光染色发现在不同组织成虫盘中敲低HDAC3都能调控Hippo信号通路的活性,而对成虫盘发育产生的影响存在差异,可能是因为各个组织涉及的Hippo信号通路的元件不尽相同导致它们对通路的响应也有所不同。另外,有研究报道果蝇翅膀成虫盘中HDAC3的缺失会引起促凋亡基因hid表达增加,促进细胞凋亡,造成翅膀成虫盘体积减小[51],这与我们的实验结果一致。进一步地,我们通过遗传上位性分析明确了HDAC3在Hippo信号通路中的作用节点位于Sd的上游,通过Yki-Sd这一途径发挥作用。最后,我们通过体外细胞实验发现HDAC3的缺失可以抑制Sd-Yki转录复合体的转录活性,从而抑制Hippo信号通路靶基因的表达。

总的来说,我们通过遗传学筛选发现组蛋白去乙酰化酶HDAC3参与Hippo信号通路的调控。蛋白质去乙酰化作为常见的翻译后修饰,通过影响蛋白质稳定性、蛋白 蛋白相互作用和蛋白亚细胞定位等来调节蛋白质的功能[56]。HDAC3作为蛋白质去乙酰化酶,被报道在多种肿瘤中起到致癌作用[57],而HDAC3抑制剂能够竞争性地结合HADC3,起到缓解氧化应激、调控免疫响应、影响细胞周期和抑制细胞凋亡的功能[58-61]。临床上已开发多种HDAC3抑制剂作为抗肿瘤药物[52-54,61],因此,进一步阐述HDAC3调控Hippo信号通路的作用机制,将为开发HDAC3抑制剂靶向Hippo信号通路的癌症治疗提供思路。有研究表明HDAC3抑制剂CG200745能够诱导胆管癌细胞表达miR-509-3p,进而下调YAP和TEAD4的蛋白水平[61]。基于我们的研究结果,我们猜想HDAC3可能直接作用于Yki/YAP,介导Yki/YAP的去乙酰化修饰从而增强Yki/YAP和Sd/TEAD的结合,并促进它们的转录活性,但这一猜想仍有待进一步研究。