基于生物信息学方法构建肝细胞癌铁死亡相关基因预后风险模型

郝 继，柳科军，2，牛一鸣，唐超峰，2，惠永峰，2，陈本栋，2，卜 阳，3

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝的恶性肿瘤，因复发和缺乏有效治疗而预后不佳。目前，HCC已成为世界上第五大最常见的癌症，死亡率位居第二位[1]。对于HCC患者的治疗方法主要有手术切除、移植与靶向药物治疗等，但这些措施仅仅只对30%～40%的病人有效，剩余患者只适用于姑息与对症治疗，且肝细胞癌切除术后的5年复发率可达40%～70%[2-3]。尽管近年来新辅助化疗、分子靶向药物和免疫治疗等综合治疗方式的发展提高了肝细胞癌的疗效，但患者的远期生存预后仍不乐观。因此，需要更多较为敏感及可靠的预后指标来监测肝细胞癌的进展与评估患者的生存预后情况，从而为患者制订个体化临床诊疗策略提供可靠的依据。HCC的发生、进展及侵袭转移的过程不仅与肿瘤细胞的病理特征有关，还受到肿瘤微环境及机体抗肿瘤免疫反应的影响，这其中就包括了炎症反应对肿瘤微环境的影响。炎症反应能够诱导肿瘤细胞的激活增殖、逃避免疫抑制、抵抗细胞凋亡、无限复制、血管新生以及侵袭转移，同时也能产生以活性氧自由基(ROS)为代表的化学物质，从而进一步诱导肿瘤的侵袭转移[4]。铁死亡是一种不同于细胞凋亡、细胞坏死等死亡机制的细胞程序性死亡[5-6]。其发生的主要原因在于细胞内Fe2+发生聚集，从而导致细胞内脂质ROS增加，脂质过氧化水平的显著升高，或者通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、胱氨酸-谷氨酸逆向转运体(Xc-system)等细胞内主要的抗氧化机制，从而使细胞死亡[7-8]。研究表明，p62-Keap1-NRF2通路可以增加铁或ROS代谢过程中的基因表达来保护HCC细胞免受铁死亡，而索拉菲尼也被证实在HCC的铁死亡中起到了重要作用，应用索拉菲尼和Erastin共同处理肝细胞的癌细胞时，铁死亡负调节因子Nrf2被抑制，成视网膜细胞瘤基因(RB)蛋白下调，并且发现在索拉菲尼导致的铁死亡中，RB蛋白的水平起到了关键调节作用[9-10]。基于上述研究发现，本研究通过公共数据库获取铁死亡相关基因的表达谱数据，探讨铁死亡相关基因与HCC癌患者生存预后之间的关系，并构建预后模型，评估由铁死亡相关基因构成的预后模型对HCC患者生存预后的预测价值，有望为评估HCC患者的生存预后提供可靠的临床参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据收集：本研究相关的HCC的基因表达图谱及相应的临床数据均来自于TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)数据库，去除临床资料与生存资料不完整的数据，最终收集了360例患者的基因组图谱、临床病理及临床资料。通过与TCGA数据库中的基因表达谱取交集，最终从FerrDb(http：//www.zhounan.org/ferrdb/)数据库纳入了25个铁死亡相关基因进行研究。TCGA与FerrDb的数据都是公开的，因此，我们的研究无须获得当地伦理委员会批准。此外，本研究遵循TCGA与FerrDb的数据访问和使用准则。

1.2 功能富集分析：采用Metascope在线数据库对铁死亡相关基因进行基因本体论(GO)分析和基因组百科全书(KEGG)分析，如无特殊标注，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 统计学方法:采用R软件(V3.8.3)比较正常组织与肿瘤组织中铁死亡相关基因的差异性表达，并绘制基因热图；采用PERSON相关分析以确定基因间的相关性；采用单因素COX和Lasso回归分析构建HCC的预后模型并将所有患者分为高风险与低风险2组，通过Kaplan-Meier曲线比较2组的总体生存率，使用受试者工作特征曲线(ROC)评估该模型的预测效果；采用多因素COX回归分析确定影响HCC患者生存预后的独立危险因素，并构建列线图模型(Nomogram图)，绘制Calibration图对列线图的拟合情况和预测能力进行评估。

2 结果

2.1 HCC中铁死亡相关基因的表达:与正常组织相比，其中22个铁死亡相关基因(CISD1,ATP5MC3,GPX4,HSPB1,RPL8,ACSL4,HSPA5,EMC2,SLC7A11,CS,FANCD2,TFRC,SLC1A5,CARS1,ATL1,NFE2L2,NCOA4,LPCAT3,FDFT1,DPP4,MT1G,SAT1,CDKN1A,GLS2,ALOX15)在HCC组织中显著上调(图1，封二)。Pearson相关分析表明，25个基因之间存在相关性。其中，LPCAT3与NCOA4相关性最高，相关系数为0.64；NFE2L2和LPCAT3，NFE2L2和NCOA4也有较强的相关性，其相关系数分别为0.58和0.61(图2，封二)。

2.2 功能富集分析:GO富集分析和KEGG通路分析差异表达的铁死亡相关基因的生物学功能和机制。在GO基因富集中，可以得出铁死亡的相关基因在氧化应激诱导的细胞凋亡、对伽马射线的反应及谷胱甘肽代谢等生物过程中明显富集，在线粒体外膜、细胞色素及黑素体等细胞成分中富集；此外，在分子功能水平，主要富集于Hijacked molecular function、Virus receptor activity和Protein binding involved in protein folding等；在KEGG功能富集分析，差异表达基因在与肿瘤代谢等相关通路中是明显富集的(图3，封二)。

2.3 Lasso、COX模型的构建:单因素COX回归分析铁死亡相关基因与HCC患者总体生存率的相关性，得到了6个与OS显著相关的差异表达基因(P<0.05)(图4a，封二)；同时构建Lasso、COX模型：0.128*CARS1+0.148*FANCD2+0.173*SLC1A5+0.227*SLC7A11，计算出肝细胞癌患者的风险评分，依据风险评分的中位值将所有肝细胞癌患者分为高风险组与低风险组(图4b-d，封二)。K-M生存分析结果表明，低风险组总体生存期比高风险组长,差异有统计学意义(P<0.05)(图4e，封二)。ROC曲线结果显示，1年、3年和5年生存率的曲线下面积分别为0.765、0.673和0.687(图4f，封二)。

2.4 铁死亡基因的预后价值及列线图的构建:单因素COX回归分析显示，T分期(HR=2.598，95%CI:1.826～3.697，P<0.05)、病理分期(HR=2.504，95%CI:1.727～3.631，P<0.05)及风险评分(HR=10 806，95%CI:1.272～2.564，P<0.05)与肝细胞癌患者的总体生存率显著相关；多因素COX回归分析结果显示，铁死亡相关基因的风险评分(HR=1.833，95%CI:1.257～2.673;P<0.05)是影响HCC患者总体生存率的独立危险因素(P<0.05)。最终，将T分期、病理分期、性别、年龄、BMI、AFP、CHILD分级及血管浸润等纳入Nomogram图中构建出评估预后的风险评分模型。通过Nomogram图可以对模型中的每个变量进行评分，然后将所有变量的得分相加，得到总分后，根据总分向下绘制垂直线，就可以得出HCC患者的1年、3年及5年生存率(图5a，目录后)。同时，诺莫列线图及校准曲线均提示，本预后模型有较好的预测能力(C指数为0.709，P<0.05)，见表1与图5b(封三)。

表1 影响HCC癌患者术后生存预后因素的COX比例风险模型评估

3 讨论

肝癌是一种高度异质性的疾病，在全球范围内发病率及死亡率仍然较高且预后相对较差，严重威胁着人类的健康和生命。长期以来，大量的分子生物标志物如miRNA、蛋白编码基因、长链非编码RNA、甲基化基因启动子等被证实在HCC患者中异常表达，其中大多数具有潜在的临床应用价值[11]。然而，由于HCC发病机制的复杂性，涉及细胞周期调控和信号转导以及多基因在多个阶段的相互作用[12]。通过筛选与肿瘤形成、进展和转移相关的基因网络，建立新的HCC预后模型来提高肝细胞癌患者的个体化预后预测的准确度，并对肝细胞癌患者的治疗提供了一定的指导意义。目前，肝脏铁超载被人们普遍认为是引起肝脏疾病的主要原因之一，铁死亡可能在HCC的恶性进展中充当着重要角色。与细胞凋亡、坏死和焦亡不同，铁死亡是一种氧化性、铁依赖的细胞死亡形式，是一种受调控的被动细胞死亡形式，在肝癌、肝纤维化、肝衰竭、肝缺血-再灌注损伤、非酒精性脂肪变性等多种肝脏疾病中，铁死亡引起了广泛的关注[13]。在肝细胞特异性Trf基因敲除的小鼠中，喂养高铁饮食增加了它们对铁死亡引起的肝纤维化的脆弱性，而铁抑制剂可使上述症状恢复正常[14]。一项动物实验表明，铁死亡是非酒精性脂肪性肝炎的诱导剂，可导致肝损伤、免疫细胞浸润和炎症反应[15]，同时介导了对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭[16]。此外，由于癌细胞的代谢比较旺盛，线粒体易出现功能障碍，从而可以导致癌细胞内ROS积累较多，对铁死亡的敏感性增加。癌细胞可以通过超氧化物歧化酶(SOD)、GPX4和过氧化氢酶等应激反应和激活抗氧化机制来清除细胞内积累的ROS，以达到防止ROS对自身造成损伤的效果[17]。因此，铁死亡相关基因对于恶性肿瘤的治疗与预后具有重大意义。本研究通过对TCGA数据库挖掘和分析，筛选出的4个铁死亡相关基因(SLC1A5、SLC7A11、FANCD2、CARS1)组成的预后模型对肝细胞癌预后有较好的预测价值，有望对肝细胞癌患者治疗及生存预后的早期评估提供一定的指导意义。

溶质载体家族1成员5(SLC1A5)是一种依赖钠离子的转运蛋白，被证实在HCC组织中显著增加，可通过增强肿瘤细胞对谷氨酰胺的摄取能力以促进HCC细胞的增殖[18]。在Erastin和Rsl3诱导的铁死亡中，谷氨酰胺代谢可诱导脂质ROS的产生并促进细胞死亡[19]。MiR137或小分子抑制剂对SLC1A5的抑制能强烈抑制谷氨酰胺分解而导致铁细胞死亡[20]。SLC1A5介导的谷氨酰胺转运在肿瘤细胞代谢、增殖和铁死亡中发挥着关键作用，阻断SLC1A5可以成功阻止黑色素瘤[21]、非小细胞肺癌[22]、前列腺癌[23]和急性髓系白血病[24]中的肿瘤细胞增殖。SLC7A11可以与SLC3A2共同组成胱氨酸-谷氨酸逆向转运体(Xc-system)，可将细胞内谷氨酸与细胞外的半胱氨酸进行转换并用来合成谷胱甘肽。而GPX4是一种重要的抗氧化酶，可以将脂质过氧化物还原为脂醇，当GPX4受到影响时可增加细胞的氧化应激，所以通过抑制Xc-system或GPX4，可以使细胞内过氧化物增加，从而导致铁死亡，可能为治疗癌症提供新的治疗途径[25-27]。同时，索拉非尼被证实，通过抑制Xc-system而增加氧化应激对肝细胞癌细胞的细胞毒性作用，诱导肝细胞癌细胞发生铁死亡[28]。此外，SLC7A11的下调最终导致细胞内胱氨酸水平的丧失以及随后的谷胱甘肽生物合成的耗损，从而间接抑制GPx4的活性并激活铁死亡[29]。SLC7A11的高表达可抑制细胞内ROS水平，而通过抑制SLC7A11在细胞内的表达来诱导铁死亡，被证实可能是抑制突变小鼠肿瘤发展的机制之一[30]。研究表明[31]，范可尼贫血(FA)通路参与细胞DNA损伤修复,范可尼贫血蛋白(FANCD2)缺陷细胞对乙醛暴露的敏感性较高，在含有FANCD2基因缺陷的小鼠中也可观察到这种现象。进一步研究发现，向细胞系中添加乙醛，刺激了移除DNA链间交联所必需的FANCD2单泛素化作用。FANCD2和FANCI的单泛素化形成FANCD2-FANCI异二聚体，结合到DNA上可将其他DNA修复因子引入DNA链间交联[32]。因此，具有FANCD2突变体的小鼠可以发展为急性白血病[31]。此外，β2-蛋白是转化生长因子β (TGF-β)的转录辅助因子，通过激活FANCD2在肝细胞中修复酒精诱导的DNA损伤中发挥关键作用[33]。当TGF-β/β2蛋白信号通路受到抑制时，FA-DNA修复通路可能出现缺陷。当FA-DNA修复通路出现缺陷后，需要非同源端连接(NHEJ)和替代非同源端连(Alt-NHEJ)来确定FA-DNA修复通路失效后乙醛诱导的小鼠造血系统DNA损伤情况[34]。FA途径的作用不能被取代，因为NHEJ途径诱导了随后的诱变修复和可选末端连接。ALDH2缺陷的FA患者胚胎发育不良、造血干细胞功能障碍和癌症易感性加重[31，34]。KOMATSU[35]等的研究表明，FANCD2在肝细胞癌组织中的表达上调，且较高的FANCD2表达预示着较差的总体生存率；FANCD2被认为是肝细胞癌患者肿瘤侵袭性的标志和预后不良的因素，可能是一个潜在的治疗靶点。通过抑制CARS1的表达，可以导致转硫途径代偿性增加，进而导致半胱氨酸的增加，抑制Erastin诱导的铁死亡[36]。本研究提示，SLC7A11、FANCD2、CARS1及SLC1A5可能与肝细胞癌侵袭转移、肿瘤细胞代谢相关，因此这4个基因呈现高表达的肝细胞癌患者多存在肿瘤易早期侵袭转移、生存预后差等特点，故在本模型中所预测的预后更差。运用Cox比例风险模型分析也显示铁死亡相关基因风险评分预后模型是影响肝细胞癌患者术后总生存时间的独立预测因素，诺莫列线图及校准曲线图也证实了我们构建的预后模型具有良好的预测能力。由此可见，铁死亡相关基因可作为肝细胞癌的预后标记物。

此外，为了进一步探索铁死亡相关基因在肝细胞癌发生发展中的作用机制，对肝细胞癌组织中差异表达基因进行GO分析和KEGG分析，结果发现差异表达基因就主要富集于谷氨酰胺代谢、氧化应激反应等生物学过程及线粒体与细胞色素等细胞成分。这些途径在肿瘤进展中起着重要的作用，氧化应激感受蛋白Pirin被证实与上皮间质化转移而促进肿瘤转移的机制有关[37]。GPX4受到影响时可直接增加细胞的氧化应激并诱导细胞铁死亡，比如索拉非尼被证实可以通过抑制GPX4增加氧化应激诱导肝细胞癌细胞发生铁死亡[28，38],而来源于线粒体的ROS被证实可能参与了半胱氨酸减少所导致的肝细胞癌细胞铁死亡[39]。此外，JANA[40]等的研究表明与正常组织相比，肝细胞癌组织中的细胞色素p450表达明显下调，且肝细胞癌患者更容易收到药物毒性的影响，对药物治疗如索拉菲尼更加敏感。由此可以得出，铁死亡可能通过这些途径参与了肝细胞癌的恶性进展，铁死亡相关基因可能是肝细胞癌的预后预测因子和治疗靶点。

本研究也存在一定的局限性，研究基于TCGA的个体来源，没有独立队列的验证，缺少外部数据集的验证，还需要更多的实验室研究来进一步验证这些发现。但通过对25个最重要的铁死亡相关基因进行了全面的生物学分析，比以往单个基因对疾病影响的研究更为全面。

综上所述，本研究初步表明，铁死亡相关基因的表达水平在HCC的进展中发挥了重要作用，同时，我们成功构建出基于铁死亡相关基因的肝细胞癌预后模型，对肝细胞癌患者的个体化治疗提供理论依据，并提高了肝细胞癌患者的生存预后预测结果的准确度。