LncRNA-NBAT1介导miR-21/PTEN轴调控子宫内膜癌细胞侵袭转移的机制研究

田春花，陈 冲，吴 阳，马 钊，马鸿云

子宫内膜癌(EC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率居妇科恶性肿瘤首位[1]。近年来EC的发生率及死亡率逐年上升，且呈年轻化趋势[2-4]。侵袭转移是EC重要的生物学特征之一，也是EC人群死亡的主要原因[5]。有研究发现，长链非编码RNA(LncRNA)在胚胎发育、基因表达和肿瘤发生等过程中发挥重要作用，且参与了子宫内膜癌的发生发展过程[6]。亦有研究显示，LncRNA成神经细胞瘤相关转录本1(NBAT1)最早被发现于神经母细胞瘤，其在神经母细胞瘤中呈低表达，由此可见LncRNA-NBAT1可抑制肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭，并可作为患者预后的重要评价指标[7-8]。本研究旨在探讨EC侵袭转移的分子机制，并寻找子宫内膜癌的治疗靶点，为EC患者临床防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂：人子宫内膜癌细胞株HEC-1A和Ishikawa；293T细胞；mimic NC、miR-21-5p mimic、海肾质粒、LncRNA-NBAT1野生型双荧光素酶载体、LncRNA NBAT1突变型双荧光素酶载体(中洪博元分子实验室提供)；DP103-02质粒小提试剂盒、DP209-02普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物)；BM161 Trans15K DNA Marker、6×1 018 DNA Loading Buffer、CD201-01 Trans5α(Trans)；FD1134 SacI、FD0694 XhoI、FD0505 HindIII(Thermo Scientific)；D6950-01 Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ(OMEGA)；AP101-100-kit Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit、CCS102 Cell Cycle Staining Kit(联科生物)；CW0580S Trizon Reagent、CW0627S miRNA Purification Kit 提取试剂盒、CW0581M Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒、CW0014S BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪)；MR101-02 miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit、MQ101-02 miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、R223-01 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(诺唯赞)；2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M，生命互联)； Marker(#26617，Thermo)；PVDF膜(IPVH00010， Millipore)；牛血清白蛋白(A8020，索莱宝)； TA-08 Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、ZB-2305辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、ZB-2301辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金桥，1/2 000)； ab32199 Rabbit Anti PTEN；RG027双荧光素酶报告基因检测试剂；L3000015 LipofectamineTM3000 转染试剂。

1.2 LncRNA-NBAT1过表达载体构建:用NCBI查找基因序列NBAT1(NR_034143.1)，引入酶切位点(HindⅢ:AAGCTT；XhoI:CTCGAG)，生物合成目的基因片段并连接到pcDNA3.1(+)载体上。质粒转化DH5α，扩培，去内毒素大提质粒后进行质粒酶切验证，若电泳检测结果与理论值基本都相符，证明为正确的质粒。

1.3 细胞转染及处理:癌细胞传代铺板后，当70%细胞密度时，准备转染。将细胞培养基更换为1 mL无血清培养基，取2个灭菌EP管，一个加入125 μL Opti-MEM和5 μL lipofectamine 3000，另一个加入12.5 μL miRNA，混匀后室温孵育5 min；将上述EP液管混匀，室温孵育15 min后滴到六孔板孔内，将细胞放回孵箱培养；转染4 h后在六孔板中加入1 mL 20%血清含量的完全培养基。293T细胞铺板，50%细胞密度时转染，提前换成含5%血清的培养基。准备12孔板的293T细胞共21个孔，配制lipo3000组(L组)和P3000组(P组)，分出一组空白组P组，其余P组全加海肾质粒；在野生型组和突变型组中，分别对应加入野生型双荧光素酶载体和突变型双荧光素酶载体，接着再分别加mimic NC和miR-21-5p mimic，混合后室温孵育15 min；50 μL每孔加入细胞，逐滴将试剂加入12孔板中，每加完一组要晃动均匀。

1.4 Western blot检测:弃掉培养皿中的细胞培养液，每孔加入100 μL的细胞裂解液，置于冰上20 min。将细胞刮至一侧，用移液枪吸入已做好标记的细胞。12 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液移至新EP管，总蛋白置于-20 ℃保存。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。上样进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1.5 h后，用300 mA恒流转膜1.5 h。用PVDF膜孵育一抗，4℃过夜；次日PVDF膜室温孵育二抗2 h，洗膜，用发光液浸湿PVDF膜后显影成像。

1.5 荧光定量PCR(qPCR):细胞收集于培养皿中，吸除培养皿中的细胞培养液。根据细胞量每皿加入1 mL的Trizon Reagent，每使用1 mL Trizon后加入0.2 mL氯仿，miRNA、mRNA提取分别采用miRNA提取试剂盒和mRNA超纯提取试剂盒，利用紫外可见分光光度计测定miRNA和mRNA的浓度和纯度(OD260/OD280)；通过miRNA逆转录试剂盒、mRNA逆转录试剂盒分别合成micDNA和cDNA，利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系如下：miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL或2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free dH2O 8.2 μL。各引物序列见表1。反应步骤如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s，退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40个循环。β-actin作为内参，基因的相对表达量根据2-△△Ct法计算，见表1。

表1 引物信息统计情况

1.6 统计学方法：采用SPSS 20.0统计软件，计量资料多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达LncRNA-NBAT1细胞转染的qPCR验证：相较于对照组和空载组，HEC-1A和Ishikawa细胞的过表达组均呈现上调高表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1(目录后)。

2.2 miR-21-5p mimic处理过表达LncRNA-NBAT1转染后细胞的PTEN表达水平:采用Western blot检测两款癌细胞中PTEN的表达水平变化，结果见图2(目录后)。相较于对照组及NC组，HEC-1A和Ishikawa细胞过表达组中PTEN的表达均呈现上调高表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 miR-21-5p mimic处理过表达LncRNA-NBAT1转染后细胞的miR-21-5p表达水平：相较于对照组和空载组，HEC-1A细胞和Ishikawa细胞的LncRNA-NBAT1组、LncRNA-NBAT1过表达+mimic NC组均呈现下调表达，LncRNA-NBAT1 NC+mimic组呈上调表达(P<0.05)，见图3(目录后)。

2.4 qPCR检测各组细胞中LncRNA-NBAT1、miR-21-5p和PTEN的mRNA表达水平：在子宫内膜癌细胞中，LncRNA-NBAT1过表达组、LncRNA-NBAT1过表达+mimic NC中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA的表达量高于他组(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA表达量最低，差异有统计学意义(P<0.05)；而LncRNA-NBAT1过表达组、LncRNA-NBAT1过表达+mimic NC组中miR-21-5p mRNA的表达量低于其他组(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中miR-21-5p mRNA的表达量最高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组细胞中NBAT1、miR-21-5p和PTEN的mRNA表达水平

3 讨论

尽管近年来临床研究人员在肿瘤的发生、发展以及治疗领域内取得了显著进展，但肿瘤的临床治疗仍存在诸多有待解决的问题[9]。在诸多癌细胞中，LncRNA与miRNA之间的关系多为LncRNA靶向抑制下游的miRNA表达[10-11]，随后解除miRNA对下游靶基因的转录或翻译的抑制，从而在癌症的发生及发展过程中起到重要调控作用[12-13]，这其中也包括子宫内膜癌[14]。然而有研究发现，miR-21不仅可以靶向抑制肿瘤蛋白编码基因，而且还可以靶向长链非编码基因的LncRNA GAS5从而抑制其表达[15]。这意味着miRNA和LncRNA之间还有诸多其他的相互调节方式仍不为知，这也值得更多的研究者深入研究。

在骨肉瘤方面的研究报道指出，LncRNA NBAT1/miR-21/PTEN轴是调控骨肉瘤生长、转移和凋亡的重要途径[16]。PTEN是公认的抑癌基因，是人类肿瘤中最常见的突变基因之一，在恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌和EC等肿瘤组织中均可检测到PTEN的突变[17]。有研究报道，EC组织中PTEN表达较癌旁正常组织显著降低[18]，本实验再次证实此观点。本实验结果显示，在子宫内膜癌细胞中，LncRNA-NBAT1过表达组、LncRNA-NBAT1过表达+mimic NC中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA的表达量高于空载他组(P<0.05)，在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA表达量最低(P<0.05)。由此可见，在LncRNA-NBAT1、PTEN对子宫内膜癌细胞增殖具有抑制作用；而在LncRNA-NBAT1过表达组、LncRNA-NBAT1过表达+mimic NC中miR-21-5p mRNA的表达量低于空载其他组，差异具有统计学意义(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中miR-21-5p mRNA的表达量最高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明miR-21-5p mRNA上调能够促进子宫内膜癌细胞的增殖，这与国内学者研究结果相一致[19]。

综上所述，LncRNA-NBAT1、PTEN对子宫内膜癌细胞增殖具有抑制作用，而miR-21-5p对子宫内膜癌细胞增殖具有促进作用，上调LncRNA-NBAT1后PTEN亦上调，而miR-21-5p呈下调。由此可见，LncRNA-NBAT1可通过调控LncRNA-NBAT1/miR-21/PTEN轴可以进一步加强这一调控功能，这为子宫内膜癌的临床诊断及治疗提供了理论参考。