灭活柱状黄杆菌浸泡免疫诱导草鱼中pIgR和四种细胞因子免疫应答特性的研究

许国晶，王志忠，巩俊霞，马汝芳，张金路

(山东省淡水渔业研究院，山东省淡水水产遗传育种重点试验室，山东 济南 250013)

引 言

硬骨鱼类黏膜免疫系统作为第一道抵抗病原入侵的免疫屏障，在免疫防御过程中发挥非常重要的作用[1]。鱼类黏液中除含有非特异性免疫成分外，还含有免疫球蛋白(Ig)[2]。现已在鱼类黏液中发现存在除IgM外，还有IgZ(IgZ1、IgZ2)、IgT等多种新型免疫球蛋白[3-5]。新型黏膜免疫球蛋白的发现，使硬骨鱼类黏膜免疫球蛋白的分泌及其转运机制研究成为热点。

在哺乳动物中，多聚免疫球蛋白(pIgA或pIgM)跨上皮细胞的转运是由一种跨膜糖蛋白即多聚免疫球蛋白受体(pIgR)介导的，进而发挥pIgA或pIgM阻止病原体和毒素对黏膜组织的黏附和入侵的功能[6,7]。资料显示，硬骨鱼类pIgR在分子结构以及免疫功能上与哺乳动物pIgR有很多相似之处，不仅能够结合血清及黏液中IgM及IgZ/IgT[8-11]，也可以结合多种细菌[12]，发挥免疫功能。研究发现，海豚链球菌(Streptococcusiniae)感染斑马鱼(Daniorerio)[13]、桡足动物感染大西洋鲑(Salmosalar)[14]、灭活鳗弧菌(Vibrioanguillarum)浸泡免疫大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[15]后pIgR基因表达量出现显著上调，与高等动物受到病原刺激后pIgR基因呈现上调表达趋势相似[16]。在哺乳动物中对pIgR研究显示，肿瘤坏死因子(TNF α)、干扰素(IFN γ)、白介素(IL-1β及IL-4)等细胞因子会上调/下调pIgR表达[17-20]。因此推测TNF α、IFN γ、IL-1β及IL-4等也能调控硬骨鱼类pIgR的基因表达，但是目前这方面的研究资料还很少。

本研究用灭活柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)浸泡免疫草鱼(Ctenopharyngodonidellus)，采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析草鱼组织中pIgR及细胞因子TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-4基因表达量的动态变化，进而为深入研究硬骨鱼类细胞因子对pIgR基因表达的调控作用及其机制提供支撑。

1 材料与方法

1.1 灭活柱状黄杆菌制备

柱状黄杆菌由广州仲恺农业工程学院提供。细菌在25 ℃条件下于Shieh培养基(1 L培养液中含蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，0.01 g CH3COONa·3H2O，0.01 g BaCl2·2H2O，0.1 g K2HPO4，0.05 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，0.006 7 g CaCl2·2H2O，0.001 g FeSO4·7H2O，0.05 g NaHCO3，pH7.2)中振荡培养48 h后，经10 000 r/min离心10 min，收集菌体用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤3次；用福尔马林调至终浓度1.0%，室温下放置24 h灭活。随后再次离心细菌悬浮液，收集菌体用PBS清洗3次以去除福尔马林；取100 μL菌悬液涂平板以验证细菌是否完全灭活；将完全灭活后的柱状黄杆菌菌苗置于4 ℃冰箱备用。

1.2 浸泡免疫

用于本试验的草鱼取自山东省淡水渔业研究院基地，所有草鱼在自动水循环养殖箱中暂养一周，水温保持在水温27 ℃±1 ℃。适应环境后，选取体表健康、体长为13～18 cm的草鱼，60尾草鱼随机分成两组用于试验，每组分三个养殖箱。第一组用养殖用水稀释菌液浓度为1×108CFU/mL的灭活柱状黄杆菌菌液中连续充气浸泡30 min；第二组为对照组，在0.85%PBS中浸泡30 min。

1.3 样品采集

两组鱼分别于免疫前0 h及免疫后4、8、12、24、48、72、96 h取样。每次每组随机取草鱼3尾，分别提取这3尾草鱼的皮肤、鳃、肠、肝脏、脾及头肾6种组织，提取总RNA，反转录成cDNA；保存于-20 ℃备用。

1.4 实时荧光定量PCR

利用Primer Premier 5.0软件设计用于实时荧光定量PCR的引物，引物设计模板序列来源于NCBI数据库中草鱼pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β及IL-4及核糖体RNA(18S rRNA)基因序列(表1)。

表1 实时荧光定量分析所用引物

以18S rRNA基因为内参。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒在实时荧光定量PCR仪上扩增。在20 μL的反应体系中含：10 μL的SYBR Premix Ex Taq，1.0 μL cDNA模板，各0.8 μL的正向引物与反向引物(引物的浓度为0.4 μmol/L)，加ddH2O至20 μL。反应的条件如下：扩增曲线：95 ℃ 30 s，循环1次；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次，72 ℃单点检测信号；溶解曲线：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，连续检测信号。根据所得Ct值，采用2-△△Ct法计算浸泡免疫后不同时间点pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β及IL-4在不同组织中的表达量。

1.5 数据分析

数据方差分析采用SPSS16.0统计软件，显著性水平为P<0.05。图表处理采用Origin 8。

2 结果与分析

2.1 浸泡免疫后pIgR基因表达量的变化

草鱼经浸泡免疫后，各组织中pIgR的基因水平96 h内均呈现先增加后减少的趋势，48 h内均有一峰值出现(图1)。在皮肤和鳃中pIgR基因的相对表达量在免疫后4 h开始显著上升，8 h达到最高，分别为初始对照的11.56和7.57倍，显著高于对照组(P<0.05)；肝中pIgR表达量在8 h后显著高于对照组，12 h达到峰值，为对照组的2.73倍(P<0.05)；肠中pIgR表达量在8 h后显著高于对照组，24 h达到峰值，为对照组的4.76倍(P<0.05)；在脾中pIgR表达量在24 h后显著高于对照组，头肾中pIgR表达量在12 h后显著高于对照组，均于48 h时达到峰值，分别为对照组的11.39倍(P<0.05)和1.91倍(P<0.05)。浸泡PBS对照组中pIgR表达量试验周期内变化不显著(P>0.05)。

图1 柱状黄杆菌菌浸泡免疫前后草鱼组织中pIgR相对表达量的变化

2.2 浸泡免疫后TNF α基因表达量的变化

浸泡免疫后草鱼皮肤、鳃、肠、肝、脾脏和肾组织中的TNFα基因变化趋势相同，在96 h内均呈现先上升后下降的趋势(图2)。其中皮肤和鳃中TNFα基因的相对表达量到达峰值时间最早，在12 h时达到峰值，峰值分别为对照组的2.83和2.75倍，均显著高于对照组(P<0.05)；肠、肝和脾中TNFα表达量从免疫后8 h开始显著上升，肠和肝中TNFα表达量在24 h时达到峰值，分别为对照组的2.43倍(P<0.05)和2.21倍(P<0.05)，脾中48 h达到峰值，为对照组的3.11倍(P<0.05)；肾中TNFα表达量从免疫后12 h显著高于对照组，48 h时达到峰值，为对照组的2.68倍(P<0.05)。浸泡PBS对照组中TNFα表达量试验周期内变化不显著(P>0.05)。

图2 柱状黄杆菌菌浸泡免疫前后草鱼组织中TNF α相对表达量的变化

2.3 浸泡免疫后IFN γ基因表达量的变化

在浸泡免疫柱状黄杆菌后，IFNγ基因的相对表达量变化与TNFα基因变化趋势相同，在96 h内呈现先上升后下降趋势，且在浸泡免疫24 h内均有一峰值出现(图3)。在皮肤和鳃中IFNγ基因在免疫后4 h开始显著上升，鳃中IFNγ表达量在免疫后8 h达到峰值，为对照组的25.24倍(P<0.05)；皮肤中IFNγ表达量在免疫后12 h达到峰值，为对照组的48.62倍(P<0.05)；肠、肝、脾和肾中IFNγ表达量均在免疫后24 h达到峰值，分别为对照组的7.18、14.15、10.76和8.19倍，均显著高于对照组(P<0.05)。浸泡PBS对照组中IFNγ表达量试验周期内变化不显著(P>0.05)。结果可以看出浸泡免疫引起皮肤和鳃中的IFNγ免疫应答较强，达到对照组的25～48倍。但是，IFNγ基因表达量在肠中只有对照组的7倍左右。

图3 柱状黄杆菌菌浸泡免疫前后草鱼组织中IFN γ相对表达量的变化

2.4 浸泡免疫后IL-1β基因表达量的变化

浸泡免疫后96 h内，草鱼各组织IL-1β基因相对表达量均呈现先上升后下降趋势，且在浸泡免疫24 h内均有一峰值出现(图4)；在黏膜免疫组织鳃中IL-1β表达量在免疫后4 h开始显著上升，8 h达到峰值，为对照组的36.25倍(P<0.05)；皮肤中IL-1β基因表达量在免疫后4 h开始显著上升，12 h达到峰值，为对照组的56.62倍(P<0.05)；肠、肝、脾和肾中IL-1β基因表达量均在免疫后8 h开始显著上升，24 h时达到峰值，分别为对照组的9.26、24.13、46.07和17.4倍，均显著高于对照组(P<0.05)。浸泡PBS对照组中IL-1β表达量试验周期内变化不显著(P>0.05)。结果可以看出浸泡免疫引起皮肤和鳃中的IL-1β免疫应答较早，脾中IL-1β基因表达量低于皮肤中，但高于鳃中IL-1β基因表达量。

图4 柱状黄杆菌菌浸泡免疫前后草鱼组织中IL-1β相对表达量的变化

2.5 浸泡免疫后IL-4基因表达量的变化

浸泡免疫后草鱼各组织中的IL-4基因变化趋势与其他基因相同，在96 h内均呈现先上升后下降的趋势(图5)。其中在鳃中IL-4表达量在免疫后4 h开始显著上升，8 h达到峰值，为对照组的9.93倍(P<0.05)；在皮肤中，IL-4表达量在免疫后4 h开始显著上升，12 h达到峰值，为对照组的13.69倍(P<0.05)；肠、肝和脾中IL-4基因表达量均在免疫后8 h开始显著上升，24 h时达到峰值，分别为对照组的4.47、9.53、和12.46倍，均显著高于对照组(P<0.05)；在肾中，IL-4基因表达量在免疫后8 h开始显著上升，48 h达到峰值，为对照组的7.18倍(P<0.05)。浸泡PBS对照组中IL-4表达量试验周期内变化不显著(P>0.05)。

图5 柱状黄杆菌菌浸泡免疫前后草鱼组织中IL-4相对表达量的变化

3 讨论

本研究结果表明，柱状黄杆菌浸泡免疫后，草鱼各组织中的pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-4基因表达量在96 h内呈现明显的先上调后下降，说明浸泡免疫都能有效引起草鱼pIgR及4种细胞因子的免疫应答反应。研究表明IFNγ、IL-1β、IL-4及pIgR基因各组织中的上调幅度高于TNFα基因，浸泡免疫对草鱼黏膜免疫组织皮肤和鳃中pIgR和细胞因子的基因表达影响较明显，到达峰值的时间早而且峰值较高。其中皮肤、鳃以及脾中pIgR表达量峰值远高于其他几种组织，这与大菱鮃中研究结果相似[15]，推测可能是因为皮肤和鳃直接接触外界的水环境，而脾是最重要的鱼类系统免疫器官，因此这三者免疫应答反应更显著。本研究中激活后的pIgR及细胞因子在96 h恢复到对照组水平，Tian et al.[21]结果表明加强免疫柱状黄杆菌会增强鳜鱼Ig含量并延长应答时间，因此加强免疫是否可以更长时间激活pIgR及细胞因子的应答还有待于进一步深入的研究。

本研究中浸泡免疫柱状黄杆菌后，草鱼各组织TNFα基因均呈现上调表达，但TNFα基因上调变化幅度比IFNγ、IL-1β及IL-4都要小。研究表明，重组TNF α会刺激HT-29细胞中的pIgR基因的上调表达[20]。Sheng等[22]研究发现牙鲆FG细胞系中，重组TNF α会刺激FG细胞中的pIgR基因的上调表达，并刺激细胞培养液上清中SC(secretory component)水平上升。TNF可以通过介导经典核因子κB(NF-κB)通路的激活，并提高RelB蛋白的稳定值进而提高pIgR的基因转录[23-24]。因此，浸泡免疫灭活柱状黄杆菌后，TNFα基因表达量增加可能是pIgR基因显著上调表达的原因之一，但具体原因还有待于深入研究。

本研究中草鱼各组织IFNγ基因表达量均显著增加，与之前研究中IFNγ变化趋势一致[25-26]。研究表明重组IFN γ可以刺激HT-29上皮细胞系中pIgR基因的上调表达[20]，与IL-1β、IL-4在pIgR基因表达调节中呈现协同作用[17-18]。IFN γ主要通过诱导IFN调节因子1(IRF1)和IFN调节因子2(IRF2)的表达，进而激活pIgR的基因转录[27-28]，但具体调控机制还需要进一步的研究。

本研究发现草鱼各组织内IL-1β均显著上调表达，与牙鲆(Paralichthysolivaceus)[29]、石斑鱼(Epinepheluscoioides)[30]中的研究结果一致。研究表明IL-1β可以显著刺激HT-29上皮细胞系中pIgR基因的上调表达[14]，也可以显著上调鼠小肠上皮细胞中分泌成分(SC)的表达[31]。研究表明IL-1β与IFN γ在HT-29上皮细胞系上协同上调SC(pIgR)的表达[17]。本文研究结果为进一步研究IL-1β调控pIgR基因表达提供了数据支撑。

本研究中浸泡免疫柱状黄杆菌后，草鱼各组织IL-4基因均呈现上调表达。研究表明，重组IL-4会刺激HT-29细胞中的pIgR基因的上调表达[32]，不仅可以与IFN γ在HT-29细胞系上协同调控pIgR的表达[17]，并且可以与TNF形成显著的协同作用[33]。研究发现IL-4刺激HT-29细胞诱导pIgR基因的转录需要新合成蛋白质，因此pIgR转录较慢，但是却能迅速引起不依赖于转录激活因子6激活的蛋白质的合成[33]。因此推测IL-4诱导pIgR基因表达过程中，pIgR基因的增强子中存在着不依赖于转录激活因子6的结合元件，但具体调控机制还有待于深入研究。

本文研究结果表明，柱状黄杆菌浸泡免疫后，pIgR基因表达显著上调，TNFα、IFNγ、IL-1β以及IL-4细胞因子的基因表达也显著上调，因此在硬骨鱼类中TNF α、IFN γ、IL-1β以及IL-4都可能参与调控pIgR基因表达。灭活柱状黄杆菌刺激诱导这4种细胞因子基因表达上调，进而通过相关途径[23]：IFN-γ对pIgR的调节作用与干扰素调节因子(IRF)1和NF-κB通路相关；IL-4通过其受体激活信号传导及转录激活因子6，后者与pIgR 2号外显子上的相应位点结合，调节pIgR的表达；而IL-1被证明可以活化一个MyD88依赖性信号通路，经由NF-κB途径对pIgR的转录进行调节；TNF α对pIgR的调节作用与NF-κB通路有关[34]；进而上调草鱼体内pIgR基因表达，但是这4种细胞因子调控硬骨鱼类pIgR基因表达的机制还有待深入研究。