镉暴露对文蛤和四角蛤蜊行为和生物转化功能的影响

任加云，尚 帅，夏江宝

(1.滨州学院 山东省黄河三角洲生态环境重点实验室，山东 滨州 256600； 2.滨州学院 生物与环境工程学院，山东 滨州 256600)

引 言

近年来中国近岸海域镉离子(Cd2+)污染呈上升趋势[1-2]，某些海区镉离子的浓度已经超过水产养殖用水标准[3-4]，严重威胁着对海洋环境生态安全[5-11]。双壳贝类营滤食性生活，代谢率低，富集重金属能力较强[12-13]，许多学者研究显示镉离子对贝类具有明显的毒性效应如氧化损伤，DNA损伤和细胞凋亡等[14-16]。

已有研究表明双壳贝类滤食率、耗氧率可以作为评估外界环境压力的重要行为指标[17-18]，谷胱甘肽硫转移酶(GST)作为生物转化过程中关键酶，是毒物生物转化功能的重要评价指标[19-20]，目前应用行为和生物转化指标综合评价镉离子对贝类毒性影响的研究尚未见报道。文蛤(Meretrixmeretrix)、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)为我国浅海养殖重要的经济贝类，常被作为海洋污染的指示生物[21-23]，本文研究了镉离子(Cd2+)对2种双壳贝类滤食率(filtration rate)、耗氧率(respiration rate)和谷胱甘肽硫转移酶活性的影响，比较分析了2种双壳贝类对Cd2+胁迫响应的差异，探讨了双壳贝类在Cd2+作用下行为指标和生物转化机能的关系，为我国海洋环境Cd2+污染评估和监测提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

文蛤和四角蛤蜊于2019年9月取自山东省滨州市无棣县沿海滩涂养殖基地，实验所用文蛤、四角蛤蜊为同一批苗种养殖的贝类，平均壳高为3.2±0.3 cm，海水盐度为28，海水镉离子浓度为0.513±0.021 ng·L-1。

实验用海水为当地生产的天然海盐和清洁淡水配置成盐度为28的海水，分别将文蛤和四角蛤蜊放入装有30 L海水的60×45×35 cm的塑料水槽中，连续充气，养殖海水pH值为7.8，水温为21±1 ℃，以冻干小球藻粉(Chlorellavulgaris)为饵料，日投喂量为5.0 mg·L-1，日换水1/2，共暂养14 d。

1.2 实验梯度设置

根据中国海水水质标准[24](养殖水域镉离子浓度需≤0.005 mg·L-1)，按照此标准的10倍、20倍、50倍设置实验镉离子暴露浓度，分别为0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1。暴露实验前，利用CdCl2·2.5H2O(AR级)制备高浓度Cd2+母液，然后稀释至实验所需的浓度。分别随机挑选健康的文蛤、四角蛤蜊各100只放入塑料水槽中，每种贝类每个染毒梯度均设置6个平行组，实验期间的充气、换水量和投喂等管理跟暂养期间基本一致，换水时加入海水为含对应染毒浓度Cd2+的海水，每2 d测定养殖水槽的水温、pH、盐度和Cd2+浓度等数据，实验期间各实验梯度镉离子浓度分别为0.04±0.01 mg·L-1、0.11±0.04 mg·L-1和0.28±0.08 mg·L-1。在暴露实验的第0，1，3，6，10，15天取样，每个水槽分别随机取文蛤和四角蛤蜊各6只，解剖取消化盲囊和鳃丝组织，迅速用4 ℃超纯水洗净后置于1.5 mL离心管中，保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于测定GST酶的活性，样品在采样后24 h内测定；同时取部分个体同步进行行为指标(滤食率和耗氧率)的测定实验。

1.3 文蛤和四角蛤蜊行为指标测定

本实验测定文蛤和四角蛤蜊的耗氧率和滤食率来评价两者的行为变化，具体测定方法如下：

每次取样四角蛤蜊和文蛤迅速放入烧杯中进行密闭，滤食率(FR)的测定采用Coughlan等人的方法[25]，稍加改进，该方法基于中性红色染料颗粒从水体中的损失速度来表示滤食率，将每个浓度组出水管伸缩健康的文蛤和四角蛤蜊分别放入含有100 mL中性红溶液(1 mg·L-1)的烧杯(每个烧杯1个蛤)中，在将蛤放入溶液之前，从每个烧杯中取出水测定初始浓度C0，2 h后取出蛤蜊，剩余溶液(CT)与初始溶液(C0)用5%盐酸调整pH=5，在550 nm处测量吸光度，计算中性红浓度。中性红的标准随样品一起测量，并用于建立标准曲线，从中可以推断中性红染料浓度。FR的计算公式为FR=[M/nt]log(C0/Ct)，其中FR换算为每g湿重文蛤或者四角蛤蜊的滤食率(mg·g-1·h-1)，M为水的总体积，n为蛤的数量，t为时间(h)，C0和Ct分别为两次采样的浓度值。

用校准好的氧电极连接血氧计，采用Basti等人的方法[26]分别测定在4只文蛤和四角蛤蜊测量呼吸速率(RR)。每30 min进行一次氧浓度下降测定，持续3 h，并使用以下公式计算耗氧率RR=[CT0-CTi]×V/(Ti-T0)，其中RR为耗氧率,用蛤每g湿重每小时消耗的氧气量来表示(mg·g-1·h-1)，CT0和CTi分别是时间在开始T0和Ti时间点的氧气浓度，V为密闭烧杯总溶液的体积(mL)。

1.4 谷胱甘肽硫转移酶(GST)的测定

现将消化盲囊和鰓丝在已经调配好的磷酸盐缓冲液(pH=7.7，温度为4 ℃)冰浴中进行匀浆，时间为5 min，转速为12,000 r·min-1，匀浆后取匀浆液放入1.5 mL离心管中，然后在高速冷冻离心机以10,000 r·min-1离心25 min后，取上清液作为酶液测定GST酶的活力。GST活力根据Habig等[27]的测定方法稍加改进，取200 μL酶液，快速加入磷酸缓冲液2.0 mL，H2O 400μL，GSH (15.0 mmol) 200 μL，CDNB (15.0 mmol·L-1) 200 μL，然后利用分光光度计在340 nm连续读数120 s，酶活力用每分钟每毫克蛋白催化产生的2,4-二硝基苯谷胱甘肽(2,4-dinitrophenylglutathione)的nmol量来表示，单位为nmol·mg-1·min-1；蛋白含量用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)[28]测定。

1.5 数据分析

所有数据用平均值±标准差(SD)表示，并用SPSS软件进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)检验暴露组与对照组的行为反应差异，然后通过双向方差(two-way ANOVA)分析评估各浓度组两种蛤之间各指标变化差异性。当P<0.05时，认为差异显著(*表示)，当P<0.01时认为差异极显著(**表示)，其它认为差异不显著。

2 实验结果

2.1 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊滤食率和耗氧率的影响

图1和图2分别为文蛤和四角蛤蜊在各浓度镉离子暴露下滤食率变化图。可见在镉暴露影响下，两种蛤的滤食率整体呈现下降趋势，0.05 mg·L-1暴露组的文蛤和四角蛤蜊滤食率从第3天和第1天开始明显低于对照组(P<0.05)；两者在0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1暴露组从第1天开始均显著低于对照组(P<0.05)，且在0.25 mg·L-1处理组均从第1天开始极显著低于对照组(P<0.01)。经过计算，四角蛤蜊在各个浓度镉离子处理下的滤食率幅度均显著高于文蛤(P<0.05)，其中在0.25 mg·L-1处理组在第15天文蛤的滤食率为对照组的16.7%，而四角蛤蜊为对照组的8.0%。

图1 镉离子对文蛤滤食率的影响

图2 镉离子对四角蛤蜊滤食率的影响

图3和图4分别为文蛤和四角蛤蜊在各浓度镉离子暴露下耗氧率变化图。0.05 mg·L-1暴露组文蛤的耗氧率并未出现明显变化(P>0.05)，四角蛤蜊从第6天开始显著低于对照组(P<0.05)；0.10 mg·L-1处理组的文蛤和四角蛤蜊分别从第3天和第1天明显低于对照组(P<0.05)，两者在0.25 mg·L-1处理组均从第1天开始显著低于对照组(P<0.05)。经过计算得知，各浓度镉离子影响下四角蛤蜊耗氧率降低速度比文蛤快。

图3 镉离子对文蛤耗氧率的影响

图4 镉离子对四角蛤蜊耗氧率的影响

通过计算得知两种蛤的滤食率下降幅度要明显高于耗氧率，耗氧率呈现显著下降的时间点相对于滤食率滞后。

2.2 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊消化盲囊和鳃丝GST活力的影响

图5和图6分别为文蛤消化盲囊和鳃丝在各浓度镉暴露下GST酶活性变化图。0.05 mg·L-1暴露组的文蛤消化盲囊在实验期间并未出现明显变化(P>0.05)，而鳃丝则从第3天明显高于对照组(P<0.05)，且一直上升；0.10 mg·L-1暴露组的文蛤消化盲囊从第3天开始明显高于对照组(P<0.05)，然后一直上升，而鳃丝则从第1天开始明显高于对照组(P<0.05)，在第6天达到最高值，随后下降，但未低于对照组的水平；在0.25 mg·L-1暴露组，文蛤消化盲囊从第1天开始明显高于对照组(P<0.05)，在第6天达到最高，然后下降，最后阶段仍然高于对照组的水平，而鳃丝则在第3天达到最高值，随后下降，在第15天明显低于对照组(P<0.05)。

图5 镉离子对文蛤消化盲囊GST酶活性的影响

图6 镉离子对文蛤鳃丝GST酶活性的影响

图7和图8分别为镉暴露下四角蛤蜊消化盲囊和鳃丝GST酶活性变化图。0.05 mg·L-1暴露组的四角蛤蜊消化盲囊和鳃丝分别从暴露后第3天和第1天明显高于对照组(P<0.05)，且一直上升； 0.10 mg·L-1处理组的四角蛤蜊消化盲囊从第1天明显高于对照组(P<0.05)，在第3天达到最高，随后下降，在第15天明显低于对照组(P<0.05)，而鳃丝则在第1天明显高于对照组(P<0.05)，然后下降，从第6天开始明显低于对照组(P<0.05)；0.25 mg·L-1处理组的四角蛤蜊消化盲囊在第3天达到最高值然后下降，从第10天开始显著低于对照组(P<0.05)，而鳃丝则从暴露实验第1天开始就明显低于对照组(P<0.05)，一直下降。

图7 镉离子对四角蛤蜊消化盲囊GST酶活性的影响

图8 镉离子对四角蛤蜊鳃丝GST酶活性的影响

3 讨论

3.1 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊行为指标的影响

截止目前，关于环境因素对贝类代谢行为指标影响有一定研究，一般认为，相关环境因子变化可以导致其滤食和耗氧指标的下降[17-18,29]，而针对具体污染物对文蛤和四角蛤蜊行为指标影响的研究相对较少。本实验结果表明文蛤和四角蛤蜊在镉暴露下，其行为指标整体呈现下降趋势，且浓度越高，暴露时间越长，下降越明显，目前有研究发现在二氧化钛等有毒物质作用下，贝类的滤食率和耗氧率同样呈现下降趋势[30-31]，与本实验研究结果类似，另据报道，贝类滤食率和耗氧率下降的主要是由于机体主动降低其能量消耗而导致[32]。本实验文蛤的两个行为指标被抑制的时间点明显晚于四角蛤蜊，且四角蛤蜊在暴露时间相同的情况下，相比对照组的下降幅度更大，说明四角蛤蜊的耗氧和滤食行为受到的影响更明显。耗氧率指标在个别浓度组没有变化或相对滤食率被抑制时间点滞后，说明两种蛤滤食行为能更早体现出机体对镉暴露的反应，有研究认为在毒物作用下贝类可以首先通过主动降低其摄食量来降低对污染物的摄入或者在神经系统的控制下，贝类鳃丝部位肌肉收缩和纤毛摆动行为发生变化导致其滤食行为变化更明显[33-35]，可以进一步导致贝类鳃丝耗氧和清除食物颗粒的能力下降。另外有研究表明，贝类行为指标变化与体内某些功能酶活力变化也具有一定的关系，有研究发现AChE酶活性的抑制和行为指标的抑制具有协同性[36]，所以结合体内某些代谢酶活性和行为指标的变化来判别贝类受影响的程度更全面，而本研究则结合了谷胱甘肽硫转移酶(GST)的变化来阐述与蛤行为指标变化的关系。

3.2 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊组织GST活性的影响

生物机体对污染物解毒的第一步是生物转化，分为相I和相II两个过程，其中谷胱甘肽硫转移酶(GST)为相II过程中的关键酶，可以促进一级代谢物与谷胱甘肽(GSH)结合，使其变成亲水性物质进一步解毒[37-39]，有较多的研究发现，GST酶活性在污染物的作用下会呈现升高现象，以提升机体的解毒代谢能力[40-41]，本实验结果也显示，除文蛤消化盲囊在0.05 mg·L-1处理组GST酶活性无变化之外，其余组织在低浓度组或者高浓度组的开始阶段呈现上升趋势，说明两者在低浓度Cd2+或者高浓度Cd2+短时间影响下，有能力提升GST酶活性以解毒一级代谢物，此时机体受到的毒害效应较低。但是在高浓度组后期，GST酶活性明显下降，且最后阶段均接近或明显低于对照组，这说明文蛤消化盲囊利用GST酶进行解毒的能力较强，鰓丝受到的毒害影响较为明显，特别是四角蛤蜊鳃丝GST酶活性在0.25 mg·L-1浓度组全程被抑制，之前有较多的研究也发现双壳贝类在高浓度污染物或长时间的作用下明显被抑制的情况[38,40]，对比可见，两种蛤的鳃丝GST被抑制的时间点都早于消化盲囊，鳃丝受到的毒性作用更明显，这说明两种组织特别是鳃丝由于污染物或者其一级代谢物不能及时清除，积累逐渐增多反而导致两种组织GST酶被抑制。

3.3 镉暴露影响下两种蛤受影响规律对比及各指标关系探讨

通过分析，文蛤和四角蛤蜊滤食率和耗氧率均随时间整体呈现下降趋势，且镉离子暴露浓度越高，下降越明显，而四角蛤蜊受抑制的程度更显著，两种蛤的行为指标变化敏感度存在一定的差异，结合实验期间两种蛤外部行为变化也可以看出，四角蛤蜊在0.25 mg·L-1浓度组或者长时间镉暴露下，其入水管萎缩程度较文蛤明显，四角蛤蜊摄食行为受阻显著；0.05 mg·L-1处理组的文蛤消化盲囊GST酶活性并无变化，而四角蛤蜊则明显上升，且在其它浓度组，四角蛤蜊酶活性上升开始时间点和被抑制时间点都较文蛤早，上升幅度和被抑制幅度相对文蛤显著，所以高浓度Cd2+影响下四角蛤蜊的生物转化功能受到了更明显的影响，两种蛤对重金属的解毒代谢存在差异，根据报道，不同贝类对于重金属的积累和代谢有差异主要跟每个种类消化吸收率、同化利用率和释放速率存在差异有关[42-43]，且不同种类的解毒策略包括抗氧化酶系统、溶酶体与金属硫蛋白(metallothioneins，MT)结合等功能有所不同[44]，文蛤对镉的解毒功能强于四角蛤蜊。

本实验两种蛤行为指标和GST酶活性的变化趋势对比可知，行为指标数据整体呈现下降趋势，但是GST酶活性在某些浓度组和时间段则呈现上升趋势，说明两种蛤首先通过主动降低摄食率和耗氧量来减少Cd2+的摄入，然后在低浓度或者高浓度的开始阶段，则可以通过生物转化酶的上升来促进进入体内的Cd2+的转化，而在高浓度长时间影响下，机体受镉影响的毒性反应较为明显，此时文蛤和四角蛤蜊耗氧率和摄食率的下降则可能是一种被动的反应，机体GST酶活性受到严重抑制，两种蛤已经不能完全通过主动保护性行为来降低Cd2+的摄入，此时GST酶活性、耗氧率和滤食率都呈现明显的被抑制状态，机体受到的损伤较为严重，所以文蛤和四角蛤蜊在Cd2+影响下，其主动解毒、被动受毒害时间点以及能应对解毒的Cd2+浓度范围可以在后期做进一步的研究确定。