鮰鱼肌肉组织中不动杆菌的分离及鉴定

赵 奎，汪 兰，孙卫青，熊光权，乔 宇，吴文锦，李 新，丁安子

（1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，湖北 武汉 430064；2.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）

斑点叉尾鮰（）俗名美国鮰鱼、沟鲇，属叉尾鮰科、叉尾鮰属。1984年，斑点叉尾鮰从美国引进，由于其易饲养、肉质鲜美、蛋白质含量较高，具有很大的营养价值和商品价值，因而成为我国优良的水产养殖品种之一，同时也在世界范围内被广泛接受，美国、日本等国家已对养殖斑点叉尾鮰进行了不同方面的研究。

近年来，很多文献报道不动杆菌属（）是肉类食品中的优势腐败菌之一。史云娇等研究发现，冷藏藏羊肉优势腐败菌为不动杆菌属、阴沟肠杆菌属（）、溶酪大球菌属（）、粪肠球菌属（）和气单胞菌属（）等；于美娟等对风味小龙虾的研究表明，冷藏鲜虾中以嗜水气单胞菌属（）、巨形球菌属（）、弧菌属（）、不动杆菌属、柠檬酸杆菌属（）和肠杆菌属（）为主；胡秀彩等从草鱼体内分离得到致病性厦门不动杆菌；罗土炎等从澳洲墨瑞鳕鱼体中分离得到寄鱼不动杆菌。为丰富不同来源不动杆菌的分离鉴定和低温条件下鮰鱼腐败菌的相关研究，本研究以斑点叉尾鮰为原料，在4 ℃冷库中取其背部肌肉组织进行真空包装，4 ℃冰箱中贮藏7 d，然后分离得到2 株细菌，分别编号为by 7-2、bs 7-3，进行细菌形态学观察、革兰氏染色及镜检、生化鉴定、16S rDNA测序及负染等方面研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

斑点叉尾鮰 湖北省武汉市某海鲜批发市场。

MAC培养基、营养琼脂培养基、血平板培养基 青岛海博生物技术有限公司；细菌微量生化鉴定管 广东环凯微生物科技有限公司；2×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒 天一辉远生物科技有限公司；PCR板 爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.2 仪器与设备

Mikro 120台式离心机 广州市华粤行仪器有限公司；DL-CJ-2NDH超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Thermal Cycler 2720 PCR仪、3730XL测序仪美国ABI公司；DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂；BPC-150F生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Gel DocTM XR+紫外分析仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 腐败菌的分离纯化

在4 ℃无菌冷库（使用紫外灯照射30 min）中将鮰鱼进行宰杀，去除鳞片、鱼头及内脏，进行无菌取样，取背鳍附近肌肉组织约20 g，真空包装后4 ℃冷藏7 d。在超净工作台上取适量冷藏样品切碎，然后放入装有200 mL生理盐水的锥形瓶中振荡均匀，制成菌悬液。将菌悬液进行一系列梯度稀释，取适当浓度梯度的菌悬液1 mL于LB琼脂培养基和血平板培养基中，在37 ℃恒温箱中培养24 h。挑选各个平板上白色圆形菌落，用平板划线法分离纯化菌株，选取形成菌落形状稳定的菌株并分别编号为by 7-2、bs 7-3。

1.3.2 革兰氏染色、生化鉴定及负染

分离得到的菌种进行革兰氏染色，然后镜检观察细菌的形态、大小及颜色等。将分离菌种接种至生化微量鉴定管中，然后在37 ℃培养24 h，观察并记录生化鉴定结果。参考朱艳等的方法加以修改，取菌株by 7-2、bs 7-3的菌悬液置于以福尔瓦为膜的铜网上，用质量分数4%（pH 7.0）磷钨酸溶液负染2～3 min，然后自然干燥，用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察、拍照。

1.3.3 细菌DNA提取、16S rDNA测序及PCR扩增

因传统的生化检验方法对微生物进行正确分类鉴定存在困难，而且容易出错。王恒安等用革兰氏阴性细菌检测实验卡鉴定某一菌种为醋酸不动杆菌，而16S rDNA序列分析结果和进化树分析结果显示为约翰逊不动杆菌。革兰氏染色是鉴别微生物的重要手段之一，但并不能准确鉴定微生物的物种，故进行菌种鉴定时有必要运用核酸杂交和序列分析进行鉴定。参照赵欣宇等的方法提取细菌总DNA，然后将纯化的DNA进行测序。PCR扩增体系（30 μL）为：2×PCR Mix 15 μL、DNA 1 μL、上、下游引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R：TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT，浓度均为10 mmol/L）各1 μL、ddHO 12 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、58 ℃复性30 s、72 ℃延伸45 s，循环35 次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保温。将PCR反应产物送至天一辉远生物科技有限公司进行测序。

1.3.4 系统发育树构建

通过NCBI的BLAST检索系统对菌株by 7-2、bs 7-3提取获得的16S rDNA序列进行相同序列检索，选取合理且相似性高的DNA序列，然后使用MEGA 7.0.26软件（美国MEGA公司）的邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株菌落形态、革兰氏染色及负染结果

从鮰鱼背鳍肌肉组织中分离纯化得到2 株菌株，分别编号为by 7-2、bs 7-3。细菌形态学观察、革兰氏染色镜检及负染结果为：菌株by 7-2在LB琼脂培养基上为圆形、湿润、白色菌落，进行革兰氏染色镜检结果为革兰氏阴性短杆菌，取菌悬液进行负染结果显示为短杆菌且无鞭毛（图1A～C）；菌株bs 7-3在LB琼脂培养基上为圆形、湿润、乳白色菌落，进行革兰氏染色镜检结果为革兰氏阴性短杆菌，取菌悬液进行负染显示为长杆菌且无鞭毛（图1A～C）。

图1 by 7-2、bs 7-3菌株菌落（A）、革兰氏染色（B）及负染后TEM图（C）Fig. 1 Bacterial colonies (A), Gram staining (B) and negative staining (C)of strains by 7-2 and bs 7-3

2.2 菌株生化鉴定结果

分别将菌株by 7-2、bs 7-3接种至微量生化鉴定管中，然后在37 ℃恒温箱中培养24 h。由表1可知：菌株by 7-2的硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麦芽糖、分解甘露醇、利用柠檬酸盐、DNA酶、O-F实验和氧化酶实验均为阴性；菌株bs 7-3的硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麦芽糖、分解甘露醇、DNA酶和氧化酶实验均为阴性，而利用柠檬酸盐和O-F实验为阳性。与《常见细菌系统鉴定手册》比对分析可知，菌株by 7-2和菌株bs 7-3均与不动杆菌属的生化特性基本相同。

表1 菌株by 7-2、bs 7-3生化鉴定实验结果Table 1 Biochemical test results of strains by 7-2 and bs 7-3

2.3 菌株16S rDNA基因测序、系统发育树构建及分析

分别以菌株by 7-2、bs 7-3细菌基因组DNA为模板，使用PCR扩增16S rDNA片段。由图2可知，2 个菌株均在约1 500 bp处有明显目的条带。进一步对16S rDNA测序表明，菌株by 7-2目的片段大小为1 398 bp，菌株bs 7-3目的片段大小为1 408 bp。

图2 纯化菌种16S rDNA电泳图Fig. 2 16S rDNA electropherogram of purified strains

将各个菌落的16S rDNA片段通过BLAST检索系统进行序列比对分析及构建系统进化树，由图3～4可知，菌株by 7-2与约翰逊不动杆菌亲缘关系最近，相似度达99.90%，菌株bs 7-3与抗辐射不动杆菌亲缘关系最近，相似度达99.79%。

图3 纯化菌种by 7-2系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain by 7-2

图4 纯化菌种bs 7-3系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of strain bs 7-3

3 讨 论

不动杆菌属是需氧、不发酵、氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌，极易产生抗药性，一般认为是条件致病菌。不动杆菌属被认为是重要的医院病原菌，特别是鲍氏不动杆菌，由于其具有较强抗药性，故难以治疗，且已发现由鲍曼不动杆菌引起的疑似新型冠状病毒肺炎。Visca、Wang Tian等在进行不动杆菌病例分析时，对其进行革兰氏染色，结果呈现出假阳性，本次实验同样也曾将不动杆菌染成阳性。具体分析原因，可能是部分不动杆菌属菌株具有保留结晶紫并抵抗脱色的能力，从而误将该菌认为是革兰氏阳性菌。抗辐射不动杆菌除了抗辐射外，还能抵抗一定剂量的过氧化氢和紫外照射，因此很容易从医院等环境中分离出。不动杆菌属作为致病菌，因其容易产生泛耐药性并在医院内引起医疗保健相关感染暴发而受到越来越多的关注。不动杆菌不止感染人类，也是鱼类致病菌，从而导致鱼类患病或死亡，其中约翰逊不动杆菌是导致斑点叉尾鮰肠套叠的致病菌之一，约翰逊不动杆菌的感染也会导致短须裂腹鱼大量死亡。

目前研究显示，不动杆菌属的分离源在食物中非常普遍，在果蔬、肉类、鱼类、乳和乳制品及饮用水中均有分离。不动杆菌还是一种常见的腐败菌，虽然其致腐能力较低，且不会产生有臭味的副产物，但是能增强假单胞菌和希瓦氏菌的腐败能力，主要是由于希瓦氏菌无法产生酰基高丝氨酸内酯（acyl homoserine lactones，AHLs）群体感应信号，但可以利用不动杆菌产生的3 种AHLs（C-HSL、O-C-HSL、O-C-HSL），尤其是C-HSL可以促进希瓦氏菌的生长，且希瓦氏菌利用不动杆菌产生的AHLs可产生4 倍多的胞外蛋白酶，而O-C-HSL可以增强希瓦氏菌硫氧化蛋白还原酶trxB mRNA的表达，从而加快鱼类的腐败变质。不动杆菌属是斑点叉尾鮰的优势腐败菌之一，可以利用氨基酸生长繁殖同时产生酯类、酸类等物质，造成食品变酸、腐败。抗辐射不动杆菌可生活在偏碱性的环境中，因而其产生的脂肪酶在碱性条件下具有较强的活性，对中长链脂肪具有较好的选择性。酿酒酵母能够刺激不动杆菌属某些细菌的生长，其促进因子为乙醇，原因在于部分不动杆菌缺乏生成乙醇的乙醇脱氢酶，低剂量的乙醇不仅能促进菌株生长，还可以改变其生理功能，增强不动杆菌对盐的抵抗力及致病性，从而加快鱼类腐败，增强对人的致病能力。Wang Xinyun等通过超高效液相色谱-串联质谱法评估大眼金枪鱼腐败中约翰逊不动杆菌和荧光假单胞菌共同培养的代谢变化，结果表明，由于戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、苯丙氨酸代谢和氨基酸变化，使得共同培养产生特殊的代谢产物，从而加快了腐败进程。赵丹丹等研究真菌发酵鱼糜中鲍氏不动杆菌腐败能力及其群体感应现象，结果表明，鲍氏不动杆菌具有较强的蛋白水解酶活性，在其繁殖过程中会产生大量有机酸和挥发性盐基氮。综上表明，不动杆菌属是食品中常见的腐败菌和致病菌，因而应得到广泛的重视。

4 结 论

通过平板分离纯化，从冷藏鮰鱼肌肉组织中分离、鉴定得到2 株菌株，分别编号为by 7-2、bs 7-3，经革兰氏染色、生化鉴定、16S rDNA基因测序及系统发育树分析，结果表明，by 7-2与约翰逊不动杆菌亲缘关系最近，相似度达99.90%，bs 7-3与抗辐射不动杆菌亲缘关系最近，相似度达99.79%。冷藏是鱼类运输的主要方式之一，本实验通过对鮰鱼肌肉组织进行真空包装，并在4 ℃冷藏条件下贮藏7 d，分离出不动杆菌，表明不动杆菌具有一定抗低温及在缺氧时仍能存活的能力，结果为研究鱼类腐败、丰富鱼源不动杆菌及研究不动杆菌提供了参考。