介孔硼硅酸盐玻璃微球药物载体的制备及其性能表征
2022-08-28庞力斌王德平
庞力斌, 王德平
介孔硼硅酸盐玻璃微球药物载体的制备及其性能表征
庞力斌, 王德平
(同济大学 材料科学与工程学院, 上海 201804)
介孔二氧化硅微粒具有化学稳定性好、比表面积大和表面易修饰等特点, 作为药物载体具有良好的应用前景, 但其缺乏生物活性且生物降解缓慢等在一定程度上限制了它的应用领域。为克服这些缺陷, 寻找合适的药物载体已成为重要研究方向。与纯二氧化硅相比, 硼硅酸盐玻璃具有良好的生物活性和更高的降解速率。基于此, 本研究尝试合成介孔硼硅酸盐玻璃微球(MBGMs), 并表征了其在负载和释放抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)过程中的载体特性和材料降解引发的各种功能性离子的释放行为。结果表明BMGMs具有约25 mg/g的DOX负载量,引入硼不仅可以调控MBGMs的化学活性和降解速率, 而且较高硼含量的MBGMs可促进酸性条件下的药物释放, 具有一定的酸性响应性。此外, MBGMs可在模拟体液中释放SiO44–、BO33–和Ca2+等有益骨组织生长的功能性离子, 并诱导生成羟基磷灰石, 具备良好的离子缓释能力和体外矿化活性。因此, MBGMs作为一种新颖的药物载体材料, 既可作为药物和功能离子的双重负载, 又具有良好的生物活性和降解特性, 在病理性骨缺损修复领域具有良好的应用前景。
药物载体; 硼硅酸盐玻璃; 酸性响应性; 生物活性材料
硼硅酸盐生物玻璃是在二氧化硅网络中引入B、Ca、P等组分制成的一种生物活性玻璃, 硼硅酸盐生物玻璃具有良好的生物相容性, 通过调节化学组成可以调控生物活性和降解速率, 同时释放对组织损伤修复有益的离子(SiO44–、BO33–、Ca2+等), 促进干细胞的增殖和分化, 在骨组织工程领域已引起广泛关注[6-7], 但其作为药物载体的研究尚未见相关报道。
众所周知, 在二氧化硅的玻璃网络中添加适量的其它网络形成体, 例如B元素, 即可有效调节玻璃的微观结构和性能。因此, 若将硼硅酸盐玻璃作为药物载体, 则不仅具有相当于介孔二氧化硅颗粒的药物负载功能, 而且有望实现可控的降解速率。此外, 若在玻璃网络结构中引入各种有益的元素(Ca、Sr、Cu等), 还可具有成骨和成血管等功能[8], 在病理性骨缺损修复治疗中发挥积极的辅助治疗作用, 因而具有较高的应用价值[9-10]。
本研究合成了不同B含量的介孔硼硅酸盐玻璃微球(MBGMs), 并对其理化性质进行了表征; 通过测定其负载抗癌药物阿霉素(DOX)的载药量和释放曲线, 评价了该药物载体的应用潜力; 通过体外测定SiO44–、BO33–、Ca2+等离子浓度变化而研究其离子释放行为, 评估其作为组织修复材料的体外生物矿化活性; 最后, 讨论了MBGMs作为一类新颖的药物载体在药物缓释和离子递送等方面的积极作用和在骨修复领域中的应用前景。
1 实验方法
1.1 材料
研究所用的化学试剂, 包括硅酸四乙酯(TEOS)、氨水(NH4OH, 25%)、硼酸三丁酯(TBB)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和无水乙醇(≥99.7%)均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。盐酸阿霉素(DOX)购自酷尔化学科技(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 介孔硼硅酸盐玻璃微球的合成
本研究制备了具有不同B2O3摩尔含量(0、10%、20%和40%)的MBGMs, 并将其分别命名为MBGMs-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B, 所设计的MBGMs的化学组分如表1所示。
采用改进的Stöber方法[11]制备: 首先, 将0.175 g CTAB和一定量的TEOS (MBGMS-0B、MBGMs- 10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分别为3.0、2.2、1.6和0.7 mL)加入到含有80 mL去离子水和40 mL无水乙醇的溶液中, 然后在40 ℃恒温磁力搅拌下将1 mL氨水加入上述溶液中, 用于引发TEOS的水解和聚合反应。搅拌10 min后, 先后逐滴加入一定量的TBB (MBGMS-0B、MBGMs-10B、MBGMs- 20B和MBGMs-40B分别为0、1.1、1.9和3.3 mL)和一定量的TEP (MBGMS-0B、MBGMs10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分别为0.30、0.27、0.25和0.21 mL)。搅拌30 min后, 再加入一定量的CN(MBGMS-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分别为1.9、1.7、1.5和1.3 g), 并继续搅拌3 h。然后经4000 r/min离心5 min将得到的颗粒分离出来, 用去离子水洗涤3次后, 在60 ℃下干燥过夜。最后将颗粒在600 ℃下烧结4 h (加热速率: 1 ℃/min)后即可得到不同B2O3含量的MBGMs微球。
本文在分析中国京津冀、长三角和珠三角城市群城镇居民生活电力消费趋势的基础上，运用STIRPAT模型分析了三大城市群城镇居民生活电力消费的影响因素，认为京津冀城市群城镇居民用电呈现“产业结构主导型”模式，长三角城市群城镇居民用电呈现“人口主导型”模式，珠三角城市群城镇居民用电呈现“收入主导型”模式。依据三大城市群各有特色的城镇居民生活用电模式，为推动城镇居民生活能源消费结构优化，促进各城市群，提出如下建议:
1.2.2 MBGMs表征
通过透射电子显微镜(TEM, Joel JEM-2100F)和能谱仪(EDS, Joel JEM-2100F)、扫描电子显微镜(SEM, FEI Quanta 200F)和X射线衍射(XRD, Rigaku D/max2550)对MBGMs的微观形貌和物相进行表征。通过氮吸附和解吸测试分析MBGMs的结构特征(NOVA 2200e, Quantachrome Autosorb)。
表1 MBGMs的设计摩尔组成
为评估MBGMs的体外矿化活性, 将MBGMs微球浸泡在模拟体液(SBF)中一定时间后, 通过SEM和XRD观察和分析羟基磷灰石(HA)的生成。此外, 通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES, PerkinElmer Optima 8300)研究MBGMs在磷酸盐缓冲盐液(PBS)中的降解速率和离子释放行为。具体过程为: 将10 mg MBGMs微球浸泡在10 mL PBS溶液中, 每天取出5 mL PBS溶液分析所含的各种离子浓度, 同时将5 mL新鲜PBS补充到浸泡液中。所有实验均重复3次(=3)。
1.2.3 载药量和释放曲线测定
抗癌药物DOX的负载实验过程如下: 将0.4 g MBGMs分散在20 mL的0.5 mg/mL DOX溶液中搅拌12 h, 然后以8000 r/min的速度离心10 min, 收集上清液用于测试DOX浓度, 同时收集MBGMs颗粒,用去离子水洗涤并干燥24 h (=3)。所得颗粒命名为MBGMs@DOX。DOX负载量()根据下式计算:
其中,0为原DOX溶液浓度(0.5 mg/mL),1为离心后上清液中DOX浓度,为DOX溶液体积(20 mL),为MBGMs颗粒质量(为最大理论载药量, 未将洗涤过程的损失计算在内)。
DOX的释放曲线按如下方法测定: 通过搅拌和超声将15 mg MBGMs@DOX分散在2 mL不同pH的PBS缓冲液中。然后, 将2 mL分散液加入预处理的透析袋中(截留分子量为7000 Da)后, 将透析袋密封并浸入18 mL pH相同的缓冲液中, 放入37 ℃恒温振荡器中以100 r/min的速度振荡。在预先设定的时间点, 取出4 mL浸泡液测试DOX浓度, 同时将4 mL新鲜缓冲液补充到浸泡液中(=3)。释放的DOX的质量()按下式计算:
其中,为释放的DOX总量,C为第次所取浸泡液的DOX浓度,为缓冲液体积(20 mL),0为每次所取浸泡液体积(4 mL)。
通过紫外–可见吸收光谱仪测试DOX溶液的浓度。实验前配置了一系列不同DOX浓度的标准溶液, 并绘制了吸光度–DOX浓度标准曲线, 然后通过该标准曲线来确定DOX浓度。
2 结果与讨论
图1显示了MBGMs微球的TEM照片, 表明改进的Stöber法成功合成了直径约400 nm的单分散介孔微球。表2是根据能谱分析(EDS)结果所计算得到的MBGMs的实际组成, 结果显示MBGMs的组成呈现硼含量梯度变化趋势。图2(A～D)是MBGMs微球的SEM照片, 与TEM照片相似, 都显示实验成功制备了粒径约400 nm的单分散微球。所制备的微球XRD图谱(图3(A))显示, 4种MBGMs均为无定形材料。可见, 本研究成功合成了单分散、无定形的介孔硼硅酸盐玻璃微球。
为了评估MBGMs的体外矿化活性, 将MBGMs微球浸泡于SBF模拟体液(pH 7.4)中观察磷灰石的生成情况。SEM照片表明浸泡3 d后MBGNs微球的表面变得粗糙(图2(A1～D1)), 有矿物沉积, XRD结果证实了该矿物为羟基磷灰石(图3(B))。矿化结果表明MBGMs可以诱导羟基磷灰石生成, 具有良好的体外生物活性, 在骨缺损修复和再生领域具有良好的应用潜力[12-13]。
图1 MBGMs的TEM照片
(A) MBGMs-0B; (B) MBGMs-10B; (C) MBGMs-20B; (D) MBGMs-40B
表2 根据EDS能谱所计算的摩尔MBGMs组成
图2 MBGMs在SBF中浸泡3 d前(A～D)和后(A1～D1)的SEM照片
(A, A1) MBGMs-0B; (B, B1) MBGMs-10B; (C, C1) MBGMs-20B; (D, D1) MBGMs-40B
图3 MBGMs在SBF中浸泡3 d前(A)后(B)的XRD图谱
图4 MBGMs氮气吸附/解吸附等温线(A)、MBGMs在pH=5的PBS中浸泡3 d前(B)和后(C)的孔径分布
根据氮吸附/解吸附结果, 由BET理论计算MBGMs-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B四种MBGMs微球的比表面积分别为259、231、221和212 m2/g。此外, 四种MBGMs的等温线表现为IV型等温线, 回滞环的形状表明MBGMs为具有窄孔径分布的介孔材料(图4(A)), 孔径分布集中在4 nm左右(图4(B)), 以上结果表明MBGMs具有较高的比表面积和较窄的孔径分布, 是一种潜在的药物载体。MBGMs在PBS溶液(pH 5)中浸泡3 d后的孔径分布如图4(C)所示, 浸泡后微球孔径分布发生变化, 孔径逐渐变大, 而且孔径增大的程度与B2O3含量有关。B2O3含量越高, 孔径增大的程度越大, 其中MBGMs-40B的孔径变化范围最大。这是由于引入硼降低了玻璃结构的致密性和玻璃抵抗酸腐蚀的能力, 在酸性条件下, 微球的微观结构更容易被破坏, 导致孔径更容易扩大。
为了研究MBGMs的降解和离子释放行为, 通过ICP-OES测定了各种离子在PBS浸泡液中的浓度。结果表明MBGMs可以释放多种离子到浸泡液中(图5)。而且随着硼含量增大, 降解速率逐渐增大, 其中MBGMs-40B的化学活性最高, 降解最快。在所有MBGMs中, SiO44–、BO33–和Ca2+离子都可有效释放, 表明MBGMs除了可作为载体缓释药物, 还可缓释SiO44–、BO33–和Ca2+等功能性离子, 促进骨组织再生的生物学功能[14-15]。
为了验证MBGMs作为药物载体的可行性, 本实验首先测试了MBGMs负载抗癌药物DOX的负载量。根据测试结果计算的MBGMs-0B、MBGMs- 10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B的DOX负载量分别为(24.85±0.50)、(24.80±0.53)、(24.53±0.64)和(24.50±0.71) mg(DOX)/g(MBGMs)。DOX释放曲线(图6)显示, MBGMs@DOX可以将DOX有效释放到模拟体液中。4种微球7 d的药物释放量均未超过40%, 可能是受到药物释放机理的限制, 因为药物主要通过物理吸附作用负载并利用浓度差扩散, 其释放量在体积有限的溶液中达到相对平衡, 表现为后期释放相对平缓, 尤其是在酸性条件下, 微球被侵蚀和降解, 导致结构变得疏松多孔, 对药物的吸附作用增强, 会更早达到平衡值。其中MBGMs- 0B@DOX和MBGMs-10B@DOX在酸性条件下(pH 5)释放的药物比在生理模拟条件下(pH 7.4)释放的药物少, 而MBGMs-20B@DOX和MBGMs- 40B@DOX在酸性条件下释放的药物比在偏碱性条件下更多更快, 表现出一定的酸性响应性释放, 这对骨髓炎以及骨肿瘤等病理微环境通常为酸性的病变区域来说, 其药物递送具有积极意义[16-17]。
图5 MBGMs在PBS中降解释放Si(A)、B(B)和Ca(C)离子的释放曲线
图6 MBGMs@DOX在不同pH的PBS中的DOX释放曲线
(A) MBGMs-0B@DOX; (B) MBGMs-10B@DOX; (C) MBGMs-20B@DOX; (D) MBGMs-40B@DOX
对于较低和无B含量的样品, 酸性条件的药物释放慢于生理环境, 其原因推测如下: 在偏碱性的生理条件下, 微球中的Si会与OH–发生反应, 微球发生降解, 导致较高的药物释放量; 而B含量较低时, 微球稳定性也较高, 微球抗酸腐蚀能力较强, 造成微球在酸性条件下降解较慢, 药物仅凭浓度差进行扩散释放。这两方面的作用导致MBGMs- 0B@DOX和MBGMs-10B@DOX在酸性条件下药物释放量低于生理环境。
随着硼含量增大, MBGMs微球的化学稳定性逐渐降低, 抗酸腐蚀能力下降, 微球更容易降解(图5),导致MBGMs-20B@DOX和MBGMs-40B@ DOX在酸性条件下的药物释放比较高。而这与MBGMs-20B和MBGMs-40B在酸性条件下孔径会进一步扩大的结果一致, 其中在酸性PBS中浸泡3 d后, MBGMs的孔径普遍变大, 孔径变化程度依次为MBGMs-40B> MBGMs-20B>MBGMs-10B>MBGMs- 0B(图4(C))。
MBGMs活性的提高主要是由于引入B降低了二氧化硅网络的稳定性, 因为B2O3-SiO2玻璃由[BO3]三角体和[SiO4]四面体两种结构单元组成, 而[BO3]三角体会形成二维平面结构, 破坏[SiO4]四面体所形成的三维立体网络结构[18]。此外, 引入其他成分如P2O5和CaO也可以进一步调节B2O3-SiO2玻璃的稳定性[19]。因此, 与纯二氧化硅或硅酸盐玻璃相比, 本研究合成的B2O3-SiO2-P2O5-CaO硼硅酸盐玻璃微球具有更高的降解速率。正是由于硼硅酸盐玻璃更高的降解速率和组成的可调控性, 可以释放多种功能性离子, 用于递送各种有益离子促进组织与细胞的增殖与分化[15,20]。
3 结论
本研究使用改进的Stöber方法成功合成了具有不同B含量单分散的MBGMs。MBGMs具有约400 nm的粒径、狭窄的孔径分布(孔径集中在4 nm左右)和较高的比表面积等特性; 可有效负载抗癌药物DOX, 负载量约为25 mg(DOX)/g(MBGMs)。引入B可调控MBGMs的化学活性和降解速率, 特别是B含量较高的MBGMs (MBGMs-20B和MBGMs-40)B能够在偏酸性的环境下更多更快地释放DOX, 其药物释放行为表现出一定的酸性响应性。同时MBGMs具有较高的降解活性和组成可调控性, 除了作为SiO44–、BO33–和Ca2+等功能性离子的递送载体, 还具有较高的生物活性, 在模拟体液中能够诱导羟基磷灰石生成, 具有良好的体外矿化活性。综上, 本研究制备的MBGMs具有作为药物和离子的递送载体, 以及生物活性骨修复材料的潜力, 在病理性骨缺损修复领域具有应用潜力。
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Drug Carrier Based on Mesoporous Borosilicate Glass Microspheres: Preparation and Performance
PANG Libin, WANG Deping
(School of Materials Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 201804, China)
Mesoporous silica particles have characteristics of excellent chemical stability, large specific surface area and convenient surface modification, showing promising application in drug carriers. However, their lack of bioactivity and slow biodegradation rate limit this application. To overcome these shortcomings, creating suitable biomaterials for drug carriers has become an indispensable and, therefore, important research direction in materials science. Compared with pure silica or silicate glasses, borosilicate glasses with excellent bioactivity degrade faster, enabling them suitable and favorable for drug carriers. Here, we synthesized mesoporous borosilicate glass microspheres (MBGMs) and characterized their properties of loading and releasing an antitumor drug, doxorubicin hydrochloride (DOX), and releasing their own various ions triggered by degradation. The results showed that BMGMs had a DOX loading amount of about 25 mg/g. Introduction of boron improved chemical activity and degrading rate of MBGMs, resulting in more DOX released in acidic enviroment than alkaline condition, which displayed a certain acid-responsive drug releasing behavior. Meanwhile, MBGMs can release functional ions such as SiO44–, BO33–and Ca2+, and induce hydroxyapatite formation, indicating sustained ion releasing ability and excellent bioactivity. Altogether, MBGMs, as a novel kind of drug carrier, have a potential application in the field of pathological bone defect repairing.
drug carrier; borosilicate glass; acid sensibility; bioactive material
1000-324X(2022)07-0780-07
10.15541/jim20210621
TQ174
A
2021-10-07;
2021-11-24;
2021-12-16
国家自然科学基金(51772210); 国家重点研发计划(2018YFC1106302)
National Natural Science Foundation of China (51772210); National Key R&D Program of China (2018YFC1106302)
庞力斌(1997–), 男, 博士研究生. E-mail: panglibin@foxmail.com
PANG Libin (1997–), male, PhD candidate. E-mail: panglibin@foxmail.com
王德平, 教授. E-mail: wdpshk@tongji.edu.cn
WANG Deping, professor. E-mail: wdpshk@tongji.edu.cn
