不同流动相组成对雌马酚对映体拆分的影响

罗云，张文静，张洪亮，徐进

（1.温州大学 化学与材料工程学院，浙江 温州325035； 2.大庆师范学院，黑龙江 大庆 163458）

雌马酚（Equol），淡黄色粉末，分子式为C15H4O3，相对分子质量为242.7，化学名称为3-(4-羟基苯基)四氢苯并吡喃-7-醇，结构式如图1 所示。它属于非甾体雌激素类，具有两种对映体形式，即S-雌马酚和R-雌马酚，结构式如图2 所示。

图1 雌马酚对映体的结构式

图2 雌马酚单一对映体的结构式

雌马酚是高度亲油性的，这使得它在水中极不溶。它的熔点约为189～190 ℃[1-2]。雌马酚被认为是所有大豆异黄酮中最活跃的代谢物，与前体大豆异黄酮相比，它具有更高的抗氧化和雌激素活性[3-5]，对抗肿瘤、抗氧化活性、抗炎活性、心血管保护等都具有一定作用。研究表明，S-雌马酚对雌激素受体β的选择性亲和力比R-雌马酚高11 倍左右。另外，不同的对映体在生物活性方面表现出多样性，这表明它们适合多种临床应用[6]。目前，大豆异黄酮已经被广泛研究，雌马酚是大豆异黄酮在体内的主要活性代谢物。越来越多的证据表明，大豆异黄酮通常不会直接发挥雌激素活性，而大豆异黄酮的最终肠道代谢产物S-雌马酚具有较高的雌激素活性，现已被广泛研究[7-8]。但是，据推测，饮食习惯和遗传因素也会影响体内的雌马酚的产生。因此，在体外生产雌马酚的方法不断发展。所以，对雌马酚的拆分研究极其重要。

对雌马酚的拆分是通过高效液相色谱法进行的，色谱技术是利用不同物质对固定相有不同的吸附解析能力导致的保留时间不一样，来达到分离的目的[9]。批处理分离方法凭借分离稳定、快速、成本低等优势应用在各个化工领域的生产中[10]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

雌马酚对映体（＞98%），上海毕得医药科技有限公司；正己烷（95%）和无水乙醇（99.9%），HPLC级， 百灵威科技公司； 1,3,5- 三叔丁基苯（TTBB），＞98%，TCI；Chiralpak AD 柱（100 mm×10 mm，20 μm），大赛璐手性技术公司；高效液相色谱仪，Agilent 1260，Agilent 公司；Sartorius BSA224SCW 电子天平；Julabo F34-ED 超级恒温水浴；德国Brand 电子移液枪；SB-4200D 超声波清洗机。

1.2 雌马酚对映体紫外全波长扫描实验

使用紫外可见分光光度计对配制好的25 mL 0.01 g·L-1雌马酚对映体溶液进行200～500 nm 波段全波长扫描，取同一容量瓶中准备好的两份样品进行实验。

1.3 色谱条件

Chiralpak AD 手性制备柱，正己烷与乙醇体积比例分别为80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流动相，在实验过程中用中央空调和水浴控温为25 ℃。

1.4 泵流量的校正实验

高效液相色谱的泵的精准性不是固定不变的，会因为使用磨损等原因使其存在一定的误差，所以在实验之前要对泵的流量进行校正。本实验所用的高效液相色谱Aglient 1260 是二元泵，假定为A 泵、B 泵，需要对其分别进行校正。

因流动相的配比对泵流量的校正实验没有影响，所以选取流动相为正己烷、乙醇（体积比80∶20）进行实验。

1.5 色谱系统管路死体积和色谱柱孔隙率的测定实验

0.50 g·L-1TTBB 溶液和0.50 g·L-1雌马酚对映体溶液的配制：分别用分析天平称取0.012 5 g 的TTBB和雌马酚于小烧杯中，然后用配置好的流动相进行溶解，转移至25 mL 容量瓶中进行定容，摇匀后标记待用。对高效液相色谱系统死体积和色谱柱孔隙率采用以TTBB 作为示踪剂的示踪法进行测定。

1.6 雌马酚对映体线性吸附常数的测定实验

用正己烷与乙醇体积比分别为80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流动相分别配置0.5 g·L-1的雌马酚溶液备用。开启仪器，设置紫外波长为280 nm，在二通连接的状态下用正己烷、乙醇（体积比80∶20）作为流动相将系统基线冲至平稳；打开恒温水浴，调整温度为25 ℃，将流动相、色谱柱、雌马酚溶液以及系统管路放进水浴中恒温至少1 h；温度稳定之后，采取针进样的方式，每次进样0.5 g·L-1的雌马酚溶液20 μ雌，采集在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL·min-1流速下的数据；流动相将系统基线冲至平稳，将流动相换为下一组配比重复步骤实验并分别保存数据。

2 结果与讨论

2.1 雌马酚对映体紫外全波长扫描实验结果

对两次的扫描结果进行处理，取平均值进行做图，得出雌马酚的最佳紫外吸收波长在225 nm 和280 nm 左右，本文选择敏感波长280 nm 进行线性实验。雌马酚的紫外全波长扫描图如图3 所示。

图3 雌马酚的紫外全波长扫描图

2.2 泵流量的校正实验结果

通过对实验得到的A 泵和B 泵数据进行处理可以得到二者在固定条件下的实际流量，将实际流量和设定流量进行做图，可以得到校正曲线。

通过两个泵的校正曲线可以看出，设定流量和试剂流量还是有一定误差的，所以，在后续的实验中，按照校正曲线进行流量的设定，例如A 泵需要流量为1 mL·min-1时，则设定值为1.028 mL·min-1。

2.3 色谱系统管路死体积和色谱柱孔隙率的测定实验结果

对所获得的以TTBB 为示踪剂的实验数据进行处理，因TTBB 所流出的峰并不是对称的，所以流出时间采用公式（3）进行计算。

再根据公式（4），以1/Q和μt分别为横坐标和纵坐标作图，即可得出系统死体积。

可得两个泵的曲线方程如下。

从A 泵和B 泵的曲线方程可以得到，系统死体积V0为0.35 mL。

色谱柱的孔隙率εt是进行后续色谱分离实验的一个重要的基础参数，也是以后对数据进行拟合时所需要的重要参数[11]，所以，对孔隙率的测定一定要准确。以TTBB 作为示踪剂，通过公式（7）直接求得色谱柱总空隙率εt。

式中：t—色谱柱连接时TTBB 的流出时间，min；

tplant—二通连接时TTBB 的流出时间，min；

Q—流速，mL·min-1；

Vcol—色谱柱总体积，mL。

根据V=Qt，联立式（7），可得式（8）：

式中：V1—系统管路死体积V0和色谱柱的死体积之和。

已经求出了系统管路死体积V0，按照同样的方法对接有色谱柱的数据进行处理做图，就能得出V1。A 泵测得的系统管路与色谱柱死体积如图4 所示，B 泵测得的系统管路与色谱柱死体积如图5 所示。

图4 A 泵测得的系统管路与色谱柱死体积

图5 B 泵测得的系统管路与色谱柱死体积

由图4 和图5 可得两个泵的曲线方程如下。

从A 泵和B 泵的曲线方程可以得到，系统死体积和色谱柱死体积一共为V1=5.94 mL。色谱柱死体积为V1减去V0为5.59 mL，通过色谱柱基础参数得出Vcol=7.85 mL，则根据式（8）可以得出εt=0.712。

2.4 雌马酚对映体线性吸附常数的测定实验

本实验在预设的5 个不同的流动相配比下，通过进样浓度较低的对映体溶液在不同的流速下进行实验，对得到的流出曲线数据进行处理，得到各个条件下的亨利常数和柱效。图6 是雌马酚对映体的流出曲线，从图6 中可以看出，两种单一对映体的分离度不是很高，不能达到基线分离，所以采用式（11）和（12）来计算单一对映体的停留时间tR和N。

图6 线性条件下的雌马酚分离谱图

式中：tR,i—保留时间；

ɛ—孔隙率；

uint—色谱柱线流速；

L—色谱柱长度；

W2/h—半峰宽；

α—约为5.54。

虽然雌马酚对映体溶液无法达到基线分离，对于半峰宽的计算可以通过先得出半峰宽的一半，将其乘以2 来计算出准确的半峰宽数据，再通过公式（12）可以得到各个单一对映体的理论塔板数。对于设定好的温度、流动相配比等条件，对tR.i和1/Q作图如图7 和图8 所示，通过得到的直线斜率来求出组分i在此条件下的亨利常数。

图7 1/Q 对t 作图确定亨利常数

图8 1/Q 对t 作图确定亨利常数

通过以上对数据的处理，可以得到各个条件下的Hi和Ni。

在不同流动相组成下的线性脉冲实验数据处理所得到的结果汇总于表1。

表1 线性脉冲实验计算结果

3 结 论

利用5 个不同组成的流动相使用Chiralpak AD柱对雌马酚对映体进行测定，以泵流量的测定、系统死体积的测定以及色谱柱孔隙率的测定作为基础，通过对不同组成流动相雌马酚对映体的流出曲线进行分析计算，得出在不同流动相下的柱效和亨利常数等参数。本研究对后续探究通过逆向法不同组成流动相对模型参数的影响，以及在考虑温度的基础上加上溶解度对模型参数的影响的探究提供了有效的基础数据，具有重要意义[12]。