八宝丹抑制TNF-α诱导C2C12成肌细胞Atrogin-1表达的研究

赵棋琴，陈进晓，沃 达，何 嘉，彭 军，3，朱伟东，任丹妮，3*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122）

癌症是全球主要死因之一［1］，50%的晚期癌症患者都患有癌症恶病质［2］，癌症恶病质是癌症患者死亡的主要原因［3］。骨骼肌萎缩是癌症恶病质最主要的临床表现，其与患者器官功能障碍、生活质量降低以及抗癌治疗的耐受性和疗效性降低相关［4］。目前缺乏治疗肌肉萎缩的有效药物，所以迫切需要研发新的药物［5］。炎症是骨骼肌萎缩的主要原因，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的肌肉萎缩诱导因子［6］，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路作为经典炎症信号通路，是炎症因子诱导肌肉萎缩的一个重要步骤［7-8］，NF-κB 信号通路可被炎症因子TNF-α激活，导致肌肉蛋白降解主要信号通路——泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）的关键组分泛素连接酶表达过度上调，最终使UPS 系统处于高度应激状态［9-10］，肌肉蛋白降解增多［11］。萎缩相关基因1（atrophy gene 1，Atrogin-1）是一种泛素连接酶，在骨骼肌中特异性表达，其过度表达会导致肌肉蛋白降解增多［12-13］。八宝丹（Babaodan，BBD）为我国经典复方，临床实践证明BBD 作为多种晚期癌症辅助用药可提高患者生活质量，缓解化疗出现的不良反应［14］，由此可见BBD 可以缓解晚期癌症患者出现的不良状态，但目前尚无BBD 治疗癌症恶病质肌肉萎缩的相关研究。故本课题拟通过体外实验探讨BBD 对TNF-α 诱导的NF-κB 信号通路及下游通路UPS 系统中Atrogin-1 表达的作用机制研究，为BBD 抑制肌蛋白降解相关通路提供了体外实验数据，也为治疗癌症恶病质提供新的治疗思路。

1 实验材料

1.1 实验细胞 C2C12 成肌细胞购于中国科学院细胞库（目录号：SCSP-505）。

1.2 实验药物 BBD 购自厦门中药厂股份有限公司（批号：190530）。

1.3 实验试剂 p-P65 抗体、p-IκB 抗体（美国CST公司，货号：3033T、2859S）；GAPDH 抗体（美国Proteintech 公司，货号：60004-1-Ig）；Atrogin-1 抗体（英国Abcam 公司，货号：ab168372）；Goat-anti-Mouse-IgG、Goat-anti-Rabbit-IgG（美国Signaling Antibody公司，货号：L3032、L3012）；DMEM 不完全高糖培养液（江苏凯基生物技术有限公司，货号：KGM12800 N-500）；胎牛血清（PEAK Serum 公司，货号：S-FBSSA-015）；青霉素和链霉素混合液、0.4%台盼蓝染液、NP-40 裂解液（北京索莱宝科技有限公司，货号：SV30010、C0040、N8032）；1×PBS 缓冲液（南京维森特生物技术有限公司，货号：311-010-CL）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司，货号：25200072）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0197）；MTT 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0009S）；蛋白酶抑制剂Cocktail、磷酸酶抑制剂Cocktail Ⅰ、磷酸酶抑制剂Cocktail Ⅱ（MCE公司，货号：HY-K0010，HY-K0021、HYK0022）；SuperKineTM超敏型ECL 发光液（Abbkine 公司，货号：BMU102-CN）；TNF-α 蛋白液（美国R&D Systems 公司，货号：410-MT）。

1.4 实验仪器 CO2培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；Countstar 全自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；倒置显微镜（德国Leica 公司）；多功能酶标仪（美国Thermo Fisher 公司）；干式恒温金属浴（上海培青科技有限公司）；SDS-PAGE 电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；Trans-Blot 小型转膜槽转膜仪（美国Bio-Rad公司）；旋转摇床（中国江苏其林贝尔仪器有限公司）；超高灵敏化学发光系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法与结果

2.1 BBD药液制备 称取25 mg BBD溶于1 mL PBS缓冲液，制备成25 mg/mL BBD 药液，储存于-20 ℃冰箱中。

2.2 细胞培养 将C2C12 成肌细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM 不完全高糖培养液中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞汇合度至70%～80%进行后续实验。

2.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，2 组比较采用独立样本t 检验。

2.4 MTT 法筛选BBD 干预细胞浓度 将C2C12 成肌细胞以3×103个/100 μL 的密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，待各组细胞汇合度至70%～80%，弃上清液，分别予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL BBD 药液干预48 h，每种浓度6 个复孔，48 h 后弃上清液，每孔加入浓度为0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，培养箱内继续孵育4 h，每孔再加入100 μL Formazan 溶解液，适当混匀，使用酶标仪在570 nm 处测吸光度，根据公式计算细胞活力。

MTT 法实验结果显示，不同浓度BBD 对C2C12成肌细胞活力无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。结合本课题组前期研究结果，最终选用0.75 mg/mL作为后续实验BBD的干预浓度［15］。

图1 不同浓度BBD 对C2C12 细胞活力的影响

2.5 筛选TNF-α 上调p-P65 蛋白表达的浓度和时间 按3×105个/mL 的细胞密度，将对数生长期C2C12 成肌细胞接种于35 mm2培养皿中，待细胞汇合度至70%～80%，分别加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干预C2C12 成肌细胞8 min。NP-40裂解液提取细胞总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒定量，细胞总蛋白中加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（还原性，5×），再将其置于100 ℃干式恒温金属浴变性。20～30 μL 蛋白样本经聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳完全分离后，TBST 洗膜3 次，通过湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，TBST 洗膜3 次，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，TBST 洗膜，抗体p-P65（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，随后TBST洗膜3 次，加Goat-anti-Mouse-IgG 或Goat-anti-Rabbit-IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST 清洗3 次，使用SuperKine™超敏型ECL 发光液显色，将GAPDH作为总蛋白内参，运用Image J 软件分析各目的蛋白的灰度值，比较不同TNF-α 浓度对p-P65 蛋白相对表达量的影响，结果见图2。与0 ng/mL 比较，10、50 ng/mL TNF-α 分别刺激细胞后，p-P65 蛋白表达均明显上调（P＜0.05），最终选取TNF-α 刺激浓度为10 ng/mL。

再筛选TNF-α 上调p-P65 蛋白表达的最佳时间，按3×105个/mL 的细胞密度，将对数生长期C2C12 成肌细胞接种于35 mm2培养皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分别在8 min、15 min、30 min、1 h 刺激细胞，提取细胞总蛋白及Western blot 法操作同前，结果见图3，10 ng/mL TNF-α 刺激细胞8 min 显著上调p-P65蛋白表达（P＜0.05），最终选取10 ng/mL TNF-α 刺激细胞8 min 作为后续实验干预浓度和时间。

图2 不同TNF-α 浓度对p-P65 蛋白表达的影响

图3 不同TNF-α 刺激时间对p-P65 蛋白表达的影响

2.6 筛选TNF-α 上调Atrogin-1 蛋白表达的浓度和时间 Atrogin-1 为NF-κB 信号通路下游通路指标，对TNF-α 蛋白反应时间不同，因此再筛选TNF-α 上调Atrogin-1 蛋白表达的浓度和时间。取对数生长期C2C12 成肌细胞按3×105个/mL 的细胞密度接种于35 mm2培养皿中，待细胞汇合度至70%～80%，分别加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干预C2C12 成肌细胞4 h，Western blot 法步骤同前，Atrogin-1 和GAPDH 抗体稀释比例分别为1∶1 000 和1∶5 000，结果见图4。与0 ng/mL 比较，1、10、50 ng/mL TNF-α 刺激细胞后，Atrogin-1 蛋白表达明显上调（P＜0.05），为与前刺激浓度一致，最终选取TNF-α 刺激浓度为10 ng/mL。

图4 不同TNF-α 浓度对Atrogin-1 蛋白表达的影响

再筛选TNF-α 上调Atrogin-1 蛋白表达的最佳时间，将对数生长期C2C12成肌细胞按3×105个/mL的细胞密度接种于35 mm2培养皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分别在8 min、15 min、30 min、1 h、4 h刺激细胞，Western blot 法操作同前，结果见图5。10 ng/mL TNF-α 刺激细胞4 h 显著上调Atrogin-1蛋白表达（P＜0.05），最终选取10 ng/mL TNF-α 刺激细胞4 h作为后续实验干预浓度和时间。

图5 不同TNF-α 刺激时间对Atrogin-1 蛋白表达的影响

2.7 BBD 对p-P65、Atrogin-1 蛋白表达的作用 按3×105个/mL 的细胞密度，取对数生长期C2C12 成肌细胞接种于35 mm2培养皿中，设置空白对照组，药物对照组、模型组、八宝丹组，待细胞汇合度达到70%～80%，药物对照组和八宝丹组加入0.75 mg/mL BBD 药液，同时空白对照组和模型组加入等体积PBS，预处理2 h。①模型组和八宝丹组加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，与此同时空白对照组和药物对照组加入等体积PBS，刺激细胞8 min 后，冰PBS 收取细胞，与上述提取细胞总蛋白及Western blot 法步骤一致，检测各组p-P65 蛋白表达；②模型组和八宝

图6 4 组C2C12 成肌细胞p-P65 蛋白表达比较

3 讨 论

肌肉萎缩是癌症恶病质患者死亡的预测因子［16］，在癌症恶病质的动物模型中，肌肉萎缩得到改善的动物模型病死率降低［17］，表明改善肌肉萎缩可能有助于提高恶病质患者生存率。成肌细胞是体外研究肌肉生长修复重要的细胞系，目前用于实验研究的成肌细胞主要是C2C12 成肌细胞［18］。因此本研究选用C2C12 成肌细胞作为研究对象。炎症是肌肉萎缩的常见触发因素，炎症因子是肌肉萎缩的有效诱导剂，TNF-α 已被证明对骨骼肌有分解代谢作用［19］，主要是通过激活NF-κB 信号通路［7］，TNF-α 通过结合并激活其同源受体TNF-αR后，促使IKKα 磷酸化IκBα 而被降解，NF-κB-IκB二聚体解离，NF-κB p65 亚单位上的S536 发生磷酸化，使得NF-κB 入核调控下游基因表达，从而导致丹组加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，同时空白对照组和药物对照组加入等体积PBS，刺激细胞4 h 后，冰PBS 收取细胞，与上述提取细胞总蛋白及Western blot 法步骤一致，检测各组Atrogin-1 蛋白表达。

图7 4 组C2C12 成肌细胞Atrogin-1 蛋白表达比较

图6 结果显示，与空白对照组比较，模型组p-P65 蛋白表达显著上调（P＜0.01），而与模型组比较，八宝丹组p-P65 蛋白表达显著下调（P＜0.01）。图7 结果显示，与空白对照组比较，模型组Atrogin-1蛋白表达显著上调（P＜0.05），而与模型组比较，八宝丹组Atrogin-1 蛋白表达显著下调（P＜0.05）。UPS 中泛素连接酶如Atrogin-1 过度上调，肌肉蛋白质降解增多［9］。故选取TNF-α 蛋白液刺激C2C12成肌细胞模拟体内炎症引起的肌肉萎缩模型，因p-P65 及下游通路指标Atrogin-1 在不同时间点对TNF-α 反应时间不一致，故分别筛选TNF-α 上调p-P65、Atrogin-1 表达的最佳浓度和时间。结果表明10 ng/mL TNF-α 刺激细胞8 min 显著上调p-P65蛋白表达，而10 ng/mL TNF-α 刺激细胞4 h 显著上调Atrogin-1 蛋白表达。

癌症恶病质归为中医“虚劳”范畴［20］，治疗原则为扶正固本、化痰祛湿、活血化瘀解毒以助癌毒消散［21］。BBD 由牛黄、蛇胆、羚羊角、麝香、珍珠、三七和两种保密药物组成，功效为清利湿热、活血解毒、通经止痛，其功效基本符合中医对癌症恶病质的治疗原则［14］。本研究发现，BBD 可抑制TNF-α诱导的NF-κB 信号通路中NF-κB 的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1 蛋白表达，表明BBD 可能通过抑制NF-κB 通路的激活进而削弱UPS 系统的活性，减少肌肉蛋白降解量。本研究为有效防治癌症恶病质肌肉萎缩提供了研究基础，但BBD 对癌症恶病质肌肉萎缩动物模型的作用有待进一步研究探讨。