低盐高碱度条件下氨氮对南美白对虾幼虾的急性毒性试验

宋国林 ，赵映灿，刘 哲

(甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

南美白对虾(Litopenaeusannamei)学名为凡纳滨对虾，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、对虾科(Penaeidae)、滨对虾属(Litopenaeus)的动物[1]，其外形与中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)、墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)极为相似。南美白对虾为广温广盐性热带虾类，成虾多生活于离岸较近的沿岸水域，幼虾栖息于饵料丰富的河口区，是目前世界上三大养殖对虾中单产量最高的优良品种[2-3]，原产于南美太平洋沿岸的水域，我国于1988年引进并大规模地推广养殖[4]。

随着市场需求的增加，全国沿海掀起南美白对虾大规模养殖热潮，其产量约占中国所有养殖虾类总产量的80%。但随着近海养殖面积的扩大以及养殖总量的增加，近海海水环境恶化，虾病发生日趋频繁。这促使南美白对虾在内陆淡水水域的养殖市场不断扩大，尤其是在盐碱地水域[5]，内陆盐碱水多表现为低盐度高碱度，盐碱水对南美白对虾胁迫相关的研究也受到了学术界的高度关注[6]。氨氮是水产养殖环境中重要的污染胁迫因子，特别是在养殖的中后期，水体中氨氮积累过量对水产动物有明显毒害作用[7-9]。长时间高浓度氨氮胁迫会影响到甲壳动物的免疫力及生长速度，甚至出现死亡，造成巨大的经济损失[6]。目前国内外关于氨氮对南美白对虾的毒性研究主要集中于自然海水养殖[9]，但对于内陆盐碱地低盐高碱度条件下氨氮对南美白对虾的急性毒性研究未见相关报道。因此，本试验通过模拟西北地区养殖生态环境，研究氨氮对南美白对虾幼虾的急性毒性试验，找出半致死浓度(LC50)和安全质量浓度(SC)，以期为内陆地区南美白对虾产业健康持续发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

虾苗：本试验采用的南美白对虾幼虾购买于广东湛江育苗场。试验前，幼虾置于体积为0.91 m×0.50 m×0.58 m、有效水量176 L的水箱中淡化暂养。初始暂养盐度为25，水温为21℃，稳定2 d后逐步降低盐度，待盐度降至5时添加NaHCO3，逐步升高总碱度至250 mg/L。暂养期间用气石连续微量充气，并利用卤虫、虾片等进行少量多次的投喂，随机挑选体质健壮、大小均匀、平均全长为(1.12±0.45)cm的南美白对虾幼虾作为试验对象。

试验药品：分析纯NH4Cl(天津市大茂化学试剂厂)；分析纯NaHCO3(天津市大茂化学试剂厂)。

试验用水：充分曝气后的自来水，用加热棒控制水温至(21.0±0.5)℃、用海水晶调节盐度至5、溶解氧7.0 mg/L，pH 8.30，用NaHCO3调节总碱度为250 mg/L。

试验容器：使用容积为2.5 L的塑料盒作为试验容器，每盒装2 L盐度为5、总碱度为250 mg/L的人工配制海水。

1.2 方法

1.2.1 预试验

试验参照《鱼类急性毒性试验方法》[10]中毒性测定法的相关规定：在塑料盒中加入1.5 L经处理盐度为5、总碱度为250 mg/L的试验用水，参照北方养殖初期池塘水温，将试验水温设置为21℃，溶解氧为6.5 mg/L，pH 8.30；每个塑料盒中放入试验对虾10尾，将氯化铵分别以10倍级差稀释成5个质量浓度组(0、0.1、1、10、100 mg/L)。试验期间停止投喂，测定水体pH值和水温，及时清污、记录并捞出死亡个体，根据试验结果，确定24 h氨氮对南美白对虾幼虾全部存活时的最高质量浓度和全部致死时最低质量浓度。

1.2.2 急性毒性试验

根据预试验确定的试验液质量浓度的范围，按等对数间距设置7个试验浓度梯度组(组别1～7)及1个空白对照组，同时每个梯度设置4个平行(表1)。每组放10尾活力好、大小均匀的南美白对虾幼虾，整个试验过程不充气、不投饵，为保证试验液的浓度保持稳定并有充足的溶解氧，每隔12 h进行吸污一次，及时用镊子剔除死亡个体并观察其特征，每隔24 h用等浓度人工配制海水换水一次，换水率为100%。用纳氏试剂光度法[11]进行氨氮测定调节，并间隔12 h监测各试验液中氨氮浓度以及水温、pH值等各项指标。定时观察南美白对虾幼虾的活力及死亡情况，并记录24、48、72、96 h南美白对虾幼虾的死亡尾数。

表1 氨氮对南美白对虾幼虾急性毒性试验浓度梯度

1.3 数据处理

试验数据利用Excel 2010软件进行处理，计算各处理组24、48、72、96 h的死亡率，死亡率=死亡的对虾数/试验对虾总数×100%；利用SPSS 25.0软件的Probit回归算法计算氨氮对南美白对虾幼虾的半致死质量浓度。再根据下列公式(1)计算安全质量浓度[12]：

安全质量浓度(SC)= 96 h LC50×0.1

(1)

分子氨(NH3-Nm)在氨氮(NH3-Nt)中所占的比例，与pH、水温及盐度有关。根据氨氮浓度可以求出分子氨浓度：

(2)

式(2)中，pKaS，T=9.24+0.003 091S+0.032 4(298-T)(T为开氏温度，T=273+t，t为摄氏温度；S为盐度；pKaS，T为电离常数)。

2 结果

2.1 南美白对虾幼虾对氨氮的中毒反应

南美白对虾幼虾从暂养水箱放入盛有试验液的塑料盒后，最初各组幼虾大多数在塑料盒底部正常游动。随着氨氮胁迫时间的延长，低氨氮浓度组的南美白对虾幼虾行为变化不明显；而高氨氮浓度组南美白对虾幼虾表现为焦躁不安，在水中多沿着塑料盒壁快速游动(离群独游)，2 h后软弱无力，易被抓捕，12 h后幼虾鳃区呈蓝绿色、虾体肌肉白浊、肝胰脏白化或淡黄色、空肠不空胃，严重者丧失游泳能力、沉于塑料盒盒底，腹肢和游泳足不摆动，用玻璃棒碰触无反应，陆续出现死亡现象，死后鳃盖张开。

2.2 氨氮对南美白对虾幼虾的急性毒性作用

氨氮对南美白对虾幼虾的急性毒性作用见表2。对照组的虾全部存活，在相同时间内，随着氨氮质量浓度的增加，南美白对虾幼虾的死亡率逐渐增加。氨氮为2.23 mg/L时，96 h累积死亡率为0%；当氨氮为89.12 mg/L时，96 h的累积死亡率均达到100%；氨氮为190.00 mg/L时，48、72、96 h累积死亡率全为100%。同一药物浓度下，随着试验时间的增加，南美白对虾幼虾的死亡率也随之增加，具有明显的剂量-时间-效应关系。

表2 氨氮对南美白对虾急性毒性试验结果

根据表2所得试验结果，通过Probit法对各时间段的死亡率对数与氨氮质量浓度进行拟合回归分析，得出半致死浓度和安全质量浓度结果(表3)。在低盐高碱度条件下，氨氮对南美白对虾幼虾的24、48、72、96 h半致死质量浓度分别为1 001.17、63.41、47.98、28.30 mg/L，安全质量浓度为2.83 mg/L；分子氨的半致死质量浓度分别为76.06、4.82、3.64、2.15 mg/L，安全质量浓度为0.22 mg/L。

表3 氨氮对南美白对虾的半致死浓度(LC50)和安全质量浓度(SC)

3 讨论

氨氮是指水中以分子氨和铵离子形式存在的氮，它是引起水生生物中毒的主要环境因子[14]。在养殖水体中，有机物中的氮被微生物降解、氨化，最终转化为氨氮。另外，虾类属于直接排氨型，其中约60%～70%的含氮排泄物是以氨氮的形式经鳃组织直接排入到养殖水环境中，其余的少数含氮排泄物以尿酸盐或尿素的形式排出[15]。氨氮中起毒害作用的物质主要是分子氨，分子氨在氨氮中占比与pH、盐度和温度密切相关，分子氨和铵离子可以相互转化。当pH值升高时，铵离子转化分子氨，分子氨含量增加，氨氮的毒性增强；水温升高，氨氮的毒性增加[13]。氨氮严重影响虾类的育苗和健康养殖，当氨氮在水中不断积累时，其自身的细胞、组织、器官和系统的生理活动将受到严重的影响[16-18]。南美白对虾氮代谢产物主要是氨氮[15]，当养殖水体环境中氨氮含量过高时，动物对氨氮代谢活动受阻，并且水体中氨氮可以通过其鳃上皮大量渗入体内[18]，会对养殖动物自身代谢所产生氨氮的正常排泄引发抑制，导致动物体内血氨的浓度升高，进而降低血液的载氧能力，影响养殖动物的呼吸作用[19]。本研究中，高浓度氨氮组幼虾死亡时鳃盖张开、体色发白，表明血蓝蛋白处于还原态，此时血液中氧含量不足，幼虾因缺氧窒息死亡，与王桂霞等[19]结论吻合。

有关氨氮对南美白对虾的毒性已有较多的报道[20-23]，而关于低盐高碱度条件下氨氮对南美白对虾的急性毒性试验未见报道。本研究结果发现，在设置的氨氮浓度范围内，幼虾的存活率与氨氮浓度呈现明显的负相关关系。这与上述报道中的结果类似，表明氨氮浓度升高会对南美白对虾幼虾产生毒性效应。甲壳动物的幼体对氨氮比较敏感，而随着个体生长以育，对氨氮的耐受性增强[24]。本试验使用全长为1.12 cm的幼虾，对氨氮和分子氨的安全质量分别为2.83、0.22 mg/L，和表4中全长5 cm幼虾的耐受性相当[22]，远高于彭自然等[21]的研究结果，因此，在低盐高碱度条件下，离子强度也会影响分子氨的浓度，其浓度随离子强度的增大而降低，氨氮毒性作用减弱。欧洲内陆渔业咨询委员会规定鱼类养殖的分子氨浓度不得超过0.025 mg/L[25]，与该标准相比，在低盐高碱度条件下，南美白对虾幼虾对氨氮的耐受性较强，且南美白对虾具有较高的经济价值，适合在西北内陆进行大面积推广养殖。

表4 氨氮对不同发育阶段南美白对虾的安全质量浓度

虾苗集中标粗时密度大，而且处于密闭的大棚中，氨氮往往超过3 mg/L，这是诱发南美白对虾“转肝期”发病的主要环境因素之一。为此，提出以下降低养殖水体中氨氮的有效途径：1)合理设计养殖密度，根据养殖条件设计适宜的养殖密度，避免放养密度过大。2)科学投饵管理，选用优质的蛋白质饲料，最好含有微生态制剂的饲料，控制投喂量，尽可能采用少量多次的方式，以防止饲料过剩带来的水质败坏。3)合理使用增氧机，增加水体的溶解氧含量，从而加快硝化反应，降低水中的氨氮浓度。4)定期更换新水，是最快、最有效减少水中氨氮的方法，降低环境胁迫力。更换的水质要好，水的温度与养殖用水体的温度要基本一致，避免幼虾因温度突变而使机体产生应激。5)定时监测水体中pH值和温度等各项指标，避免因养殖水体中pH和温度过高而导致有毒性的分子氨含量增加[26]。

4 结论

在水温为21℃、盐度为5、总碱度为250 mg/L、pH=8.3条件下，氨氮和分子氨对南美白对虾的安全质量浓度分别为2.83、0.22 mg/L。