生防菌B29产生脂肽类抗生素的发酵条件优化

周舒扬，赵晓宇，叶阳，张丕奇，戴肖东，王玉江

(黑龙江省科学院 微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010)

0 引 言

植物病害给农业造成严重经济损失，施用化学药剂是人类防治植物病害的主要策略。但是，长期大量施用化学农药导致农药残留污染环境、危害人类健康、破坏生态平衡、植物产生抗药性等问题日益突出，也降低了产品的商业价值。因此，人们逐渐将防治的重点转向生物防治[1]。

微生物源生物农药控制病害，因其高效、低毒、低残留、环保等优点而备受关注。发酵是生物制剂研发过程中的一项关键技术，是一个在适宜环境下借助于微生物特定代谢途径将特定培养物转化为人们所需品的过程[2]。微生物发酵的能力除了由菌株的遗传功能特性，还取决于适宜的培养基和发酵的环境条件。优化培养基和发酵条件可以充分发挥菌株的潜能，提高生产效率和质量，降低成本[3]。

生防菌B29菌株为黑龙江省科学院微生物研究所分离保存，菌株保藏号CGMCC 0752，经鉴定为枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)，其对多尖孢镰刀菌、立枯丝核菌及腐霉菌等多种植物病原真菌均有抑制作用，是高效广谱的生防菌株[4]。芽孢杆菌易从土壤和植株中分离得到，产生耐热和抗逆性的芽孢，具有显著的生物防治潜力，且芽孢杆菌易于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖和繁殖。因为芽孢杆菌属的菌株具有易于培养和储存的诸多优点，比其他微生物菌种更适用于生物防治领域研究[5]。另外，芽孢杆菌在生长和发酵培养中后期会产生的具有抗菌生物活性的脂肽类物质，如伊枯草菌素(iturins)、芬荠素(fengycin)和表面活性素(surfactin)等[6-8]。目前能产生脂肽类抗生素的菌产抗生素的能力普遍较低，因为脂肽类抗生素的产生受温度、pH和搅拌速度影响较大[9]，通过优化发酵条件可有效促进脂肽类抗菌物质的产生和累积，因此研究着重在培养基固定的前提条件下优化发酵条件，寻求最佳的发酵工艺参数，提高抗菌性脂肽类物质产量，为进一步扩大产品工业化生产提供基础，也为植物病害生物防治谋新径。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

生防菌B29菌株为黑龙江省科学院微生物研究所自黄瓜根围土壤中分离并保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

1.2 培养基

LB培养基：酵母粉1%，胰蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，pH调整至7.0，固体培养基添加1%琼脂粉，于1×105Pa灭菌20 min，备用。

发酵培养基：葡萄糖1%，酵母膏0.8%，NaCl 0.5%，MgSO40.02%，K2HPO40.02%，CaCO30.02%，pH调整至7.0，于1×105Pa灭菌20 min，备用。

1.3 主要设备

高速冷冻离心机：日立CR21GⅢ；台式pH仪：METTLER TOLEDO 320；全自动发酵罐：韩国Hanil SP20L fermenter。

1.4 菌株活化及种子制备

将-80 ℃保存于甘油的B29菌种于室温融化，转接于LB平板上37 ℃活化培养24 h。再挑取单菌落于5 ml LB液体培养基中30 ℃、200 r·min-1培养24 h。取20 μl菌液接种于含有50 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，30 ℃、200 r·min-1培养24 h作为发酵罐种子。

1.5 全自动发酵罐发酵生防菌B29菌株

灭菌：制备10 L发酵培养基，采用发酵罐自动程序进行灭菌，罐内压力819.2 Pa，121 ℃下灭菌15 min。

初始参数设定：发酵温度30 ℃，搅拌350 r·min-1，消沫灵敏度5。

自动控制设定：通过对全自动发酵罐溶氧和pH等参数设置，使溶氧控制与搅拌速度、通气量、NaOH溶液滴入联动，将溶氧控制在不低于30%，pH值不低于6.0且不高于8.0条件下。

1.6 脂肽类抗菌物质提取

脂肽类抗生素的提取采用酸沉淀法[10]。培养结束后，将发酵液6 000 r·min-1离心10 min，去除沉淀菌体细胞，在上清液中加入6 mol·L-1HCl使pH达到2.0，置于4 ℃离心机过夜后，再次将其7 000 r·min-1离心20 min，收集底部沉淀。将沉淀物于60 ℃的烘箱中烘干18 h，称重即得到脂肽类抗生素粗提物的干重。

1.7 Plackett-Burman试验设计响应面实验

在不改变培养基组分的条件下，利用Plackett-Burman设计方法[11]对本实验筛选的3种因素的重要性进行评估，筛选影响生防菌B29菌株产生脂肽类物质的量因素水平，确定最佳发酵工艺。采用Design-Expert 8.0软件的Plackett-Burman试验进行响应面设计，方案见表1所示。

表1 利用Plackett-Burman 设计筛选培养基的重要组分Table 1 Design of screening substrate for critical components using Plackett-Burman

1.8 验证试验

利用得到的最适发酵条件进行3次平行实验，来验证设计的模型是否可靠，从而得出最终优化结果。

2 结果与分析

2.1 响应面优化脂肽类物质产生条件

2.1.1 回归方程的建立与合理性分析。根据软件Design-Expert 8.0生成，按实验分组进行试验，并记录实验结果。实验结果如表2所示。

表2 分组实验结果Table 2 Group experiment results

式中：A是搅拌速度；B是pH；C是温度。

对方差进行分析，F值能够用来检查各变量对响应值影响的重要程度，F值越大，相应变量的重要性越大。只有回归模型的P<0.05，说明该模型具有统计学实践意义。如表3所示，每个实验对对脂肽类物质产量的影响顺序为：搅拌速度(A)>温度(C)>pH值(B)，其中搅拌速度(A)和温度(C)对脂肽的产量影响较大，在交互项AB对脂肽类物质的产量有极其重要的影响。该模型的多元相关性系数R2为0.981 1，表明该模型具有较高的显著性，而调整相关系数R2(adj)=0.956 8，可以解释实验95.68%的响应值突变，与预测相关系数R2(pred)=0.952 4相近，表明该模型与实验室得到的数据吻合度较高，具有现实指导性，因此，可以用该实验模型来分析和预测产生脂肽类物质的最优发酵条件。

表3 分组实验数据方差分析结果Table 3 Analysis of variance of grouping experimental data

2.1.2 响应面结果与分析。根据拟合回归方程，利用Design Expert软件分析得到响应面分析图和等高图(图1，图2)。从图1可以看出，搅拌速度与温度的相互作用对脂肽类物质产量的影响是呈斜拱形曲面状，搅拌速度的纵向跨度很大，其可能是影响脂肽类物质产量的一个敏感变量，发酵培养时搅拌速度应满足在260～340 r·min-1范围内。

图1 搅拌速度与温度交互作用Fig.1 Agitation speed and temperature interaction

由图2可知，pH-温度交互作用曲面中，曲面随温度变化波动幅度更大，表明温度较pH影响显著，对脂肽类物质产量受到的影响较为明显，产量前期随着pH值和温度的上升而增加，后期随pH值和温度的上升而降低。在这两个变量的影响下的发酵条件为：pH为6.5～7、温度32～33 ℃范围内最为合适。

图2 pH值与温度交互作用Fig.2 pH and temperature interaction

2.2 验证试验

根据2.1响应面对脂肽类抗生素产生情况获得最佳发酵工艺为：搅拌速度348 r·min-1、pH 6.9、温度33 ℃，脂肽类抗生素理论产量可达0.763 mg·ml-1。

经过3次平行试验，在该条件下进行3次重复平行试验测得脂肽类物质含量分别为0.761 mg·ml-1、0.759 mg·ml-1和0.763 mg·ml-1，基本与预测值接近，具备一定的良好拟合性，证实了模型的有效。

3 讨论和结论

B29菌株在田间大区示范中表现出对黄瓜枯萎病的良好防治效果，且具有一定的增产作用[12]。生防枯草芽孢杆菌的作用机制包括营养成分和位点竞争、分泌抗菌化合物、溶菌作用、诱导抗菌性和促进生长[13-14]。枯草芽孢杆菌B29菌株通过产生抗菌性脂肽类物质[15]，在黄瓜根茎部定殖、诱导宿主植物防御酶活性及促生长等多重作用而对黄瓜根部病害起到防治作用。

由于芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期可产生的具有抗菌活性的脂肽类抗生素，如伊枯草菌素、芬荠素和表面活性素等[16]。表面活性素具有较强的发泡性，而伊枯草菌素和芬荠素具有强烈的抗菌活性，也可根据所需不同的产物进行发酵条件优化。目前有关枯草芽孢杆菌的发酵条件优化都是以产糖量、产酸量或产孢量为响应值，本研究是以脂肽类物质产量为最终目标来进行发酵条件优化，以搅拌速度、pH和温度为影响因素进行发酵条件优化，得到最适发酵条件为：搅拌速度348 r·min-1、pH 6.9、温度33 ℃。

微生物发酵是实现生物防治产品工业化的重要工艺之一，其中包括优化发酵条件和液体培养基。利用Plackett-Burman(PB)可以从一系列影响因素中快速有效的优化发酵条件，因此广泛应用于微生物发酵培养基的优化筛选[17]。本研究在前期研究工作基础上，选用已经筛选获得的培养基组分为基础，采用响应面法着重筛选影响抗菌物质产生的重要发酵参数，对发酵枯草芽孢杆B29产脂肽类物质条件进行优化，提高了该菌株产脂肽类物质的能力。在实验中，搅拌速度是溶解氧的重要指标，温度和pH值则是发酵中最重要的发酵控制因素。在三个重要的调控因素条件下，三者具有非常密切的交互作用，传统正交实验不能有效获得代谢产物最佳发酵工艺，在响应面技术应用条件下，利用数学回归模型建立，可计算最合理的发酵技术参数，为进一步扩大产品中试及工业化生产提供数据支撑，为后续利用其防治多种植物病害奠定了基础，也为植物病害生物防治谋新径。