阿霉素诱导心力衰竭大鼠肠道菌群改变及益生菌对其NLRP3表达和心功能的影响

王建林 杨丽 史磊

(东营市中医院 1心内科，山东 东营 257000；2急诊科)

炎症小体是一类存在于胞质内的大分子蛋白复合体，与慢性心力衰竭(CHF)〔1，2〕等心血管疾病密切相关〔3〕。其中Nod样受体蛋白(NLRP)3炎症小体是目前研究相对最多的炎症小体，其激活后可促进炎症介质表达、释放，促进CHF发生发展〔4〕。肠道是抵御“外来侵略”的主要屏障，其正常的菌群结构在维持营养、物质代谢等机体生理活动方面发挥重要作用〔5〕。肠道菌群改变在心肌梗死、动脉粥样硬化、CHF、高血压等的发生发展中发挥重要作用〔6，7〕。益生菌是一类能够促进肠道菌群生态平衡，修复肠道屏障，有益于宿主健康的活体微生物〔8〕。益生菌能通过修复肠道屏障控制机体炎症平衡〔9〕。本研究将使用阿霉素诱导大鼠CHF模型，探讨益生菌对CHF大鼠NLRP3表达及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠，体质量(250±10)g，购自宁波康泰博科技发展有限公司，许可证号：SYXK(浙)2018-0014。

1.2主要试剂与仪器 阿霉素(货号：K0091，购自上海宝曼生物科技有限公司)；芪苈强心胶囊(国药准字Z20040141，购自石家庄以岭药业股份有限公司)；益生菌(货号：WTLS-05552，购自兰州沃特莱斯生物科技有限公司)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(货号：DEM202，购自北京拜尔迪生物技术有限公司)；苏木素-伊红(HE)染色液(货号：DH0006，购自北京雷根生物技术有限公司)；(RIPA)裂解液(货号：AR0020，购自上海吉至生化科技有限公司)；NLRP3抗体、抗体分泌细胞(Asc)抗体、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抗体、白细胞介素(IL)-1β抗体、IL-18抗体、GAPDH抗体、羊抗兔lgG(货号：ab263899、ab111852、ab138483、ab200478、ab223293、ab59164、ab205718，购自abcam公司)。

彩色超声显像仪(型号：VividE9,购自美国GE公司)；显微镜(型号：CKX41SF,购自日本Olympus公司)；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500,购自美国Applied Biosystems公司)；化学发光成像系统(型号：ChemiDocXRS,购自美国Bio-Rad公司)。

1.3分组、造模与给药 40只大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组和益生菌组各10只。用0.9%氯化钠注射液将阿霉素配制成2 mg/ml溶液，模型组、阳性组和益生菌组每只大鼠按照2 mg/kg剂量给予阿霉素尾静脉注射；同时，对照组给予等体积0.9%氯化钠注射液尾静脉注射，1次/w，连续给药7 w〔10〕。最后一次给药12 h后，阳性组按0.32 g/kg剂量灌胃芪苈强心胶囊，益生菌组按5×108CFU/kg剂量灌胃益生菌，对照组、模型组均给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续给药4 w结束。

1.4超声心动图检测 按3 ml/kg给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射，取仰卧位，胸部备皮，使用彩色超声显像仪的10 MHz高频探头获取左心室长轴二维图像，在乳头肌水平将M型取样线垂直于左心室后壁和室间隔，获得M型超声心动图，测定左心室舒张末内径(LVEDD)和左心室收缩末内径(LVESD)，计算左室射血分数(LVEF)，取连续3个心动周期的平均值。

1.5qRT-PCR检测大鼠肠道菌群 收集各组大鼠粪便样品1～2 g，提取粪便细菌基因组总DNA，利用功能菌群(乳酸杆菌、双歧杆菌和弯曲杆菌)特异性引物，采用荧光定量PCR仪检测乳酸杆菌、双歧杆菌和弯曲杆菌的丰度，结果用细菌拷贝数的常用对数/g粪便表示。

1.6HE染色观察心肌组织病理形态学改变 处死大鼠，每组取5只大鼠心肌组织，4%多聚甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋、切片，石蜡切片经脱蜡、水化后行HE染色，脱水、透明、封片，使用光学显微镜观察心肌组织病变情况并拍照。

1.7Western印迹检测心肌组织中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达情况 取每组剩余5只大鼠心肌组织，用放射性免疫沉淀分析(RIPA)裂解液裂解提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取定量蛋白，并将蛋白变性，进行凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(NLRP3抗体、Asc抗体、caspase-1抗体、IL-1β抗体、IL-18抗体、GAPDH抗体，均1∶500稀释)，4℃下孵育过夜，TBST洗涤3次，加二抗(羊抗兔，辣根过氧化物酶标记，1∶2 000稀释)，室温下孵育1 h，TBST洗涤3次，显色曝光，化学发光成像系统拍照，并使用ImageJ软件分析条带灰度，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达量。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件行方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠超声心电图参数 与对照组相比，模型组、阳性组、益生菌组LVEDD、LVESD显著升高，LVEF显著降低(均P<0.05)；与模型组相比，阳性组、益生菌组LVEDD、LVESD显著降低，LVEF显著升高(均P<0.05)；与阳性组相比，益生菌组LVEDD、LVESD显著降低，LVEF显著升高(均P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠肠道菌群变化 与对照组相比，模型组、阳性组、益生菌组粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌丰度显著降低，弯曲杆菌丰度显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，阳性组、益生菌组粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌丰度显著升高，弯曲杆菌丰度显著降低(均P<0.05)；与阳性组相比，益生菌组粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌丰度显著升高，弯曲杆菌丰度显著降低(均P<0.05)，见表2。

表1 各组LVEDD、LVESD、LVEF比较

表2 各组粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌、弯曲杆菌丰度及 心肌组织中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达比较

2.3各组心肌组织病理改变 HE染色显示，对照组心肌细胞排列整齐，轮廓清晰，未见病理学改变；模型组心肌纤维染色不均，心肌细胞变形、水肿、排列杂乱，细胞核出现碎裂或固缩，心外膜可见炎细胞浸润；阳性组、益生菌组心肌组织病变程度较模型组均有不同程度的改善，见图1。

图1 各组心肌组织病理改变(HE染色，×200)

2.4各组大鼠心肌组织中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达情况 与对照组相比，模型组、阳性组、益生菌组NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、益生菌组NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达显著降低(P<0.05)；与阳性组相比，益生菌组NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见表2、图2。

图2 各组心肌组织中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、 IL-18蛋白表达

3 讨 论

阿霉素损害心肌组织具有慢性、蓄积性的优点，已被广泛用来诱导建立CHF大鼠模型。本研究采用尾静脉注射的方式使用阿霉素诱导建立CHF大鼠模型〔11〕。人体肠道中含有大量的菌群，其平衡可以协助机体保护肠黏膜屏障，帮助机体吸收分解食物、摄取营养、调节代谢及机体免疫功能，防止病原菌及其有害副产物进入体内〔12〕。肠道菌群的失衡会引起肠黏膜屏障破坏及菌群移位，引起体循环炎症水平，进而影响机体健康〔13〕。CHF患者肠道菌群紊乱状态可表现为乳酸杆菌、类杆菌、双歧杆菌等益生菌数量减少，而沙门菌、弯曲杆菌、志贺杆菌、假丝酵母菌和耶氏森菌等肠道上皮细胞病原菌数量增多〔14〕。本结果提示CHF大鼠肠道菌群已发生明显改变。益生菌能调控血脂水平，维持大鼠体内部分抗氧化酶活力和非酶抗氧化物质水平，拮抗肝脏脂质过氧化损伤，减轻肝脏炎症，缓解肝脏受损的程度〔15〕。益生菌可能通过纠正肠道菌群结构紊乱，修复肠道屏障功能及改善肠道内环境，以保护大鼠酒精性肝损伤〔16〕。肠道菌群改变与CHF密切相关，CHF伴发的血流动力学改变可改变肠道通透性、功能及肠道菌群平衡，破坏肠道屏障〔17〕。本研究提示CHF大鼠灌胃益生菌可改善肠道菌群平衡、改善大鼠心功能，有利于大鼠病情好转。

炎症反应是CHF发病过程中的重要病理生理机制，其发生贯穿于CHF整个发生发展过程中，可诱导心肌细胞肥大、凋亡及纤维化，促进病情进展〔18〕。NLRP3炎症小体是目前研究较深入的炎性小体，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白Asc和caspase-1组成，可调控TNF-α、IL-1β、IL-18等炎症细胞因子的成熟与分泌，参与绝大多数炎症反应过程〔19，20〕。张筱琳等〔9〕研究发现，灌胃益生菌产品能够有效改善慢性肾脏病大鼠肾功能缺失性肠屏障损伤，减轻大鼠体内的系统炎症现象。本研究提示由NLRP3介导的炎症反应参与CHF发病过程，而灌胃益生菌可抑制NLRP3介导的炎症反应。