天葵子上调PRKAG2-AS1对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响

孟召莲 王振云 高燕

(济南市中西医结合医院 1神经内科，山东 济南 271100；2中医内科；3内分泌科)

胶质瘤是中枢神经系统中最具侵略性的肿瘤之一。尽管目前包括外科手术、放射疗法和化学疗法在内的治疗策略已取得进展，但由于复发和转移，胶质瘤患者的治疗效果仍不理想〔1〕。寻找有效抑制胶质瘤转移的药物一直是临床研究的重要课题。天葵子为毛茛科植物天葵的块状根茎，主要含有生物碱、香豆精类、内酯等化学成分，具有清热解毒、消肿散结、利水通淋、败毒抗癌等作用〔2，3〕。目前，以天葵子为主要成分的中药复方制剂已广泛用于食管癌、乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤的辅助治疗〔4，5〕。既往研究证实，生物碱是天葵子发挥抗肿瘤作用的有效成分，然而天葵子生物碱在胶质瘤中是否具有抗肿瘤作用尚不清楚。本研究通过观察天葵子生物碱对胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭的影响，探讨其潜在的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1材料 人胶质瘤细胞U251购于中国科学院上海细胞库；杜氏改良培养基(DMEM)培养基、胎牛血清、Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；小干扰RNA(si-RNA)购于南京金斯瑞生物科技有限公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)购于上海七海复泰生物科技公司；密理博Transwell小室购于北京优尼生物科技有限公司；PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ购于大连TAKARA生物技术公司；细胞裂解缓冲液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Ki67兔单克隆抗体、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗体、神经钙黏素(N-cadherin)兔多克隆抗体、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)兔单克隆抗体、山羊抗兔IgG二级抗体购于上海碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1细胞培养 U251细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。当细胞80%融合时加入胰蛋白酶消化，按照1∶3比例转移至新的培养瓶中培养。

1.2.2天葵子生物碱部位的制备 参考关频等〔6〕文献方法获得天葵子生物碱部位，步骤如下：取30 kg天葵子，95%乙醇煮沸温浸12 h，70%乙醇煮沸温浸12 h，重复1次，减压回收溶剂成流浸膏，得到天葵子乙醇提取物(CT)。用适量水稀释CT，离心获得上清液。将上清液上大孔树脂，分别用水、50%乙醇和95%乙醇洗脱，获得95%乙醇洗脱物。将洗脱物溶于无水乙醇，过滤除去滤除不溶部分，将得到的洗脱物氧化铝柱，再次用95%乙醇洗脱，浓缩干燥后即为天葵子生物碱部位。

1.2.3实验分组 将对数期U251细胞接种96孔板，细胞贴壁后用天葵子生物碱终浓度分别为0、1、10、100 ng/L的DMEM培养基孵育细胞24 h，依次记为对照组、天葵子-L组、天葵子-M组和天葵子-H组。为证实天葵子的抗肿瘤作用与调控PRKAG2-AS1表达有关，利用Lipofectamine2000将si-NC、si-PRKAG2-AS1转染融合度为50%的U251细胞，48 h后用含100 ng/L天葵子生物碱的DMEM培养基再孵育细胞24 h，依次记为天葵子-H+si-NC组、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1组。

1.2.4CCK-8法检测细胞活力 每组取2×103个细胞(100 μl)接种到6孔板中，细胞贴壁后，向各孔内添加10 μl的CCK-8溶液，孵育2 h后，酶标仪测量450 nm处的吸光度(A)值。细胞存活率=A对照组/A实验组。

1.2.5集落形成实验检测细胞克隆能力 每组取5×102个细胞(2 ml)接种到96孔板中，米字型晃动平板使细胞分散均匀。约培养14 d时，用甲醇固定集落，用0.1%结晶紫染色。显微镜下计算大于50个细胞的集落数。

1.2.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 采用孔径为8 μm的Transwell小室分析U251细胞的迁移和侵袭能力。侵袭实验时取50 μl的基质胶预先包被Transwell上室膜备用。将室放置在24孔板中，下室加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液；收获不同处理组U251细胞，取200 μl细胞悬液(不含胎牛血清，细胞数约为1×104个)加入到上室中。再培养24 h，棉签去除上室膜基质胶和未侵袭细胞，随后用甲醇固定附着在Transwel底部膜的细胞，0.1%结晶紫染色20 min。显微镜下随机选择6个视野进行计数，以均值表示各组侵袭细胞数。迁移实验时采用未包被基质胶的Transwell小室，其他步骤同侵袭实验。

1.2.7实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测PRKAG2-AS1表达 收获不同处理组U251细胞，Triozl试剂提取细胞总RNA，紫外线吸收法进行定量。PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ进行逆转录和RT-qPCR。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算PRKAG2-AS1的相对表达量。PRKAG2-AS1引物上游5′-CTGGGTTCATCAAGGTTTGC-3′，下游5′-GAAGACCCAGAAGTCCCACA-3′。GAPDH引物上游5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.8Western印迹检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达 细胞裂解缓冲液裂解各组细胞，收集上清液，紫外线吸收法进行蛋白定量。通过十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离20 mg蛋白样品，并利用湿法转膜仪将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室温下用含5%脱脂牛奶缓冲液封闭膜4 h，然后与Ki67抗体(1∶1 500)、E-cadherin抗体(1：1 000)、N-cadherin抗体(1∶500)4℃孵育过夜。室温下用二级抗体(1∶1 000)孵育膜4 h。增强型化学发光试剂显色，凝胶成像系统分析目的蛋白相对表达量(内参为GAPDH)。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1天葵子对U251增殖的影响 与对照组比较，天葵子-L组U251细胞存活率、克隆形成数变化无统计学意义(P>0.05)；与天葵子-L组比较，天葵子-M、天葵子-H组U251细胞存活率、克隆形成数显著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H组间上述指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2天葵子对U251迁移侵袭的影响 与对照组比较，天葵子-L组U251细胞迁移和侵袭数无显著变化(P>0.05)；与天葵子-L组比较，天葵子-M、天葵子-H组U251细胞迁移和侵袭数显著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H组间上述指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3天葵子对U251中PRKAG2-AS1表达的影响 与对照组比较，天葵子-L组U251细胞PRKAG2-AS1表达无显著变化(P>0.05)；与天葵子-L组比较，天葵子-M、天葵子-H组U251细胞PRKAG2-AS1表达显著升高(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H组间PRKAG2-AS1表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组U251细胞存活率和克隆形成数、迁移侵袭细胞数、PRKAG2-AS1表达比较

2.4干扰PRKAG2-AS1对天葵子作用的U251增殖的影响 与天葵子-H+si-NC组比较，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1组U251细胞存活率、克隆形成数显著升高(P<0.001)。见表2。

表2 干扰PRKAG2-AS1对天葵子作用的U251细胞 存活率和克隆形成数的影响

2.5干扰PRKAG2-AS1对天葵子作用的U251迁移侵袭的影响 与天葵子-H+si-NC组比较，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1组U251细胞迁移和侵袭细胞数显著升高(P<0.001)。见表3。

表3 干扰PRKAG2-AS1对天葵子作用的U251迁移 侵袭的影响个)

2.6各个处理组U251中蛋白表达的影响 与对照组比较，天葵子-L组U251细胞Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达变化均无统计学意义(P>0.05)；与天葵子-L组比较，天葵子-M、天葵子-H组U251细胞Ki67和N-cadherin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H三组间上述指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。与天葵子-H、天葵子-H+si-NC组比较，天葵子-H+si-PRKAG2-AS组U251细胞Ki67和N-cadherin蛋白表达显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图1和表4。

1～6：对照组、天葵子-L组、天葵子-M组、天葵子-H组、天葵子-H+si-NC组、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1组图1 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达

表4 Western检测各组细胞处理U251中蛋白的表达

3 讨 论

胶质瘤具有高发病率、高复发率和高死亡率特点。至今胶质瘤仍然难以治愈，平均生存时间仅为1年左右〔7〕。本研究从天葵子乙醇提取物对细胞增殖、迁移侵袭的影响和蛋白表达等多方面探讨了天葵子的抗肿瘤作用。Ki67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，其表达水平与胶质瘤的恶性程度呈正相关，是检测癌细胞增殖活性的重要标记〔8，9〕。本研究显示，中、高剂量天葵子生物碱可显著抑制U251细胞存活率和克隆形成，抑制Ki67蛋白表达，并呈剂量依赖效应。与本研究结果类似，前人研究显示天葵子生物碱部位对肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A-549、小鼠移植性S180肉瘤均有抑制生长作用〔6，10〕。上皮间充质转化(EMT)是肿瘤的侵袭转移的重要步骤。通过EMT，上皮细胞失去细胞极性和黏附能力，转化为间充质细胞，进而获得侵袭或转移性表型，抑制EMT可降低细胞的侵袭转移能力〔11，12〕。本研究结果提示，天葵子生物碱可显著降低胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，在胶质瘤中具有抗肿瘤作用。长的非编码RNA(lncRNA)是一类缺乏蛋白编码能力的长度大于200个核苷酸的转录本，其通过在转录或转录后水平调节基因表达参与调控细胞增殖和侵袭性等恶性行为，其表达失调与肿瘤发生、进展有关〔13，14〕。研究显示，lncRNA PRKAG2-AS1在肝癌、结肠中表达降低，PRKAG2-AS1可能通过影响PRKAG2表达、抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性进而在肿瘤中发挥抑癌作用〔15，16〕。胶质瘤患者血清中PRKAG2-AS1表达亦显著降低，PRKAG2-AS1低表达是胶质瘤早期诊断的潜在无创伤性生物标志物〔17，18〕。本研究结果提示天葵子的抗肿瘤作用可能调控PRKAG2-AS1表达有关。通过转染si-PRKAG2-AS1发现下调PRKAG2-AS1表达可逆转高剂量天葵子生物碱对U251细胞存活、克隆、迁移侵袭及Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响，恢复U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上研究表明，天葵子生物碱对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用可能与上调PRKAG2-AS1表达有关。