基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨活血接骨复方胶囊对闭合性腰椎骨折家兔的干预效果

许和贵 王羿 李玉雄 刘洋 王思涛 邓小龙

(1贵州中医药大学第一附属医院骨科，贵州 贵阳 550001；2贵州中医药大学)

骨折愈合过程属于一种复杂、有序的生物学修复过程，相关研究显示，血液循环状态、生物化学、物理因子、人体微量因子对骨折愈合过程产生严重的影响〔1〕。目前研究指出，有10%的骨折愈合缓慢，甚至无法愈合〔2〕，因此，促进患者骨折愈合，缩短患者愈合时间具有重要意义。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在多种细胞信号通路中发挥关键作用，参与细胞生长、分化、增殖等重要过程，是自噬通路上游主要的调节蛋白，在自噬活性中发挥着重要调控作用〔3,4〕。活血接骨复方胶囊是在贵州中医药大学附属医院骨伤科时光达老教授研究的治疗骨折的经验方之上加减并改良剂型而成，大部分患者经过活血接骨复方胶囊治疗，效果显著，能明显缩短患者骨折肿痛、愈合时间，产生的不良反应也较少〔5〕。本文基于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路探讨活血接骨胶囊对闭合性腰椎骨折模型家兔的干预效果。

1 资料与方法

1.1实验动物 选取普通级雄性家兔40只，平均体重(2.05±0.55)kg，均由贵州中医药大学动物研究所提供(生产许可证号：SCXK(黔)2012-0011)。

1.2模型建立及分组 40只家兔中选取10只为正常组，其余30只参考刘匆聪等〔6〕文献建立闭合性腰椎骨折模型，手术前将家兔脱毛处理后使用10%水合氯醛(2 ml/kg)给予腹腔麻醉，皮肤使用纱布覆盖，防止对其他部位产生损伤。采用预损伤结合逐级撞击法进行，先采用3 mm的钻头对家兔L3锥体前方、侧方皮质进行破坏，使用1 250 g重力，厚1.0 cm牵引砣从45 cm高处向下垂直冲击，控制撞击点在标本前1/3部位，如果L3未骨折，则以10 cm为一梯度逐级升高牵引砣高度，增加撞击力，直到L3骨折。术后3 d每只家兔给予青霉素80万U，防止感染。最终建模成功27只，分为模型组、对照组和活血接骨组各9只。活血接骨复方胶囊由活血接骨方(骨碎补、续断、自然铜、土鳖虫、丹参、透骨草、苏木、三七、冰片、元胡等药物)按药物比例研磨成粉制成胶囊。活血接骨组给予活血接骨复方胶囊干预，500 mg/kg，使用10 ml/kg蒸馏水配制混悬液对家兔给予灌胃给药，1次/d。正常组和模型组给予等量生理盐水进行干预。对照组给予等量的伤科接骨片进行干预。4组均连续干预4 w，家兔均给予相同的普通饲料进行喂养。

1.3检测血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酶酸(ALP)、Ⅰ型胶原、骨钙素、自噬相关蛋白(LC3)-Ⅱ及Beclin-1水平 抽取家兔腹部静脉血3 ml,以3 000 r/min，离心处理10 min后，分离上层血清。偶氮胂Ⅲ法检测钙水平，严格按照偶氮胂Ⅲ试剂盒及其相关试剂说明书进行操作；钼蓝比色法检测磷水平。酶联免疫吸附试验检测：将提前稀释好的标准品100 μl加入相应的微孔板反应空中，第1孔只加样品稀释液为零孔。盖上模板混合均匀，在37℃下处理90 min，甩去孔内液体，吸干水分；将准备好的抗体加入到每孔中0.1 ml，在37℃下处理60 min，底物四甲基联苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔内液体，每孔中加满0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔内液体，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光处理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS终止液，即蓝色变为黄色。在波长450 mm处分析ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素、LC3-Ⅱ、Beclin-1水平。

1.4骨痂厚度、Lane放射学评分 提取每只家兔骨痂组织，以骨折为中心选择10个视野，使用目镜测微尺观察骨痂厚度。Lane放射学评分标准：无骨形成，骨折线清晰为0分；骨形成占缺损<25%，骨折线部分存在为1分；骨形成占缺损的25%～75%，骨折线消失为2分；骨形成占缺损>75%，皮质骨塑型为3分。

1.5病理学观察 处死家兔，解剖后快速提取家兔骨组织制作标本，将其置于4%的多聚甲醛中进行固定，制作常规石蜡切片，在浓度0.5%苏木精-伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片。

1.6检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白 采用Western印迹检测，将采集到的血液标本3 000 r/min离心处理10 min，对上清液进行提取后，二喹啉甲酸(BCA)进行蛋白定量检测，在2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4 ℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.10%三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(TBST)给予稀释(PI3K、Akt、mTOR一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.10% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，5 min/次。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

1.7统计学处理 采用SPSS20.0软件进行方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组血清中Ca、P、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素水平比较 与正常组相比，其余3组Ca水平、骨痂厚度明显升高，P、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素水平、Lane放射学评分明显降低(P<0.05)；与模型组相比，对照组、活血接骨组Ca水平明显降低，P、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素水平及骨痂厚度、Lane放射学评分明显升高(P<0.05)；与对照组相比，活血接骨组Ca水平明显降低，P、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素水平及骨痂厚度、Lane放射学评分明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组病理学观察 正常组有成熟骨细胞个新生骨小梁分布，细胞排列整齐，细胞结构完整骨边缘界限紧密结合；模型组仅有少量的成骨细胞，细胞排列紊乱；对照组有少量的新生骨产生，但骨小梁未见完全成熟；活血接骨组有大量的成熟成骨细胞和新生骨小梁，细胞排列逐渐整齐，修复效果显著。见图1。

2.3各组LC3-Ⅱ、Beclin-1水平及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达比较 与正常组相比，其余3组LC3-Ⅱ、Beclin-1水平明显降低，PI3K、Akt、mTOR表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，对照组、活血接骨组LC3-Ⅱ、Beclin-1水平升高，PI3K、Akt、mTOR表达明显降低(P<0.05)；与对照组相比，活血接骨组LC3-Ⅱ、Beclin-1水平升高，PI3K、Akt、mTOR表达明显降低(P<0.05)。见表2、图2。

表1 各组血清中Ca、P、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素水平及骨痂厚度、Lane放射学评分比较

表2 各组LC3-Ⅱ、Beclin-1水平及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达比较

图2 各组PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达

3 讨 论

骨折是临床中的一种常见的骨科疾病，目前如何促进骨折快速愈合是临床研究的重点，目前中医药在治疗骨折方面具有一定的优势，闭合性骨折常采用中医手法复位小夹板固定辅助中药进行治疗〔7〕。在中医中，血淤属于骨折范畴，骨折损伤容易带着气血血脉离经，恶血留滞血瘀产生，气血运行失常容易引起淤积不散，主要表现为肿痛〔8〕。活血接骨胶囊具有活血化瘀、补肾强骨等作用，通过改善骨折局部的血流循环，能缓解血肿状况，对骨折部位骨基质钙盐沉淀有显著的促进作用，有助于骨痂厚度提高，通过调控骨生长相关因子，促进骨折愈合〔9,10〕。当骨折发生，通过血液循环及破骨细胞活动，将钙离子释放到血液中，导致骨折早期，钙离子浓度较高，随着患者骨折愈合时间延长，其钙离子浓度降低〔11〕。研究指出，钙、磷有助于维持机体稳定，当钙离子浓度降低，血液中磷浓度会随之升高，钙磷乘积也提高，从而促进钙盐沉积，骨折愈合时间缩短〔12,13〕。Runyan等〔14〕研究指出，骨基质钙化是骨组织修复的关键，在骨折愈合中钙盐发挥着至关重要的作用，骨组织修复必须有骨基质参与。本文研究结果提示，活血接骨胶囊能促进家兔钙盐在骨折处沉积，在骨折愈合中起到一定的积极作用。

ALP水平高低在评估骨细胞功能、分化程度等方面发挥着重要作用，其也是反映成骨细胞成熟的标志，ALP主要是由成骨细胞分泌，具有较高的特异性，在骨折愈合中，ALP水平高低能体现骨形成过程〔15〕。骨钙素属于一种非胶原蛋白，主要通过成骨细胞合成和分泌，在软骨矿化过程中具有重要作用；Ⅰ型胶原水平增加对成骨细胞增殖、分化具有一定的诱导作用，加快成骨细胞骨形成，促进骨折组织修复〔16,17〕。本研究提示活血接骨胶囊有助于增加成骨细胞数量，促进成骨细胞活性提高、促进家兔骨折快速愈合。细胞自噬主要参与的调节蛋白分子包括mTOR和PI3K，LC3是一种与酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物，主要存在于哺乳动物中，Beclin-1属于自噬中的特异性蛋白，当机体受到不同程度的刺激，细胞会将自噬激活，大量研究已证实骨组织受到创伤后细胞自噬也会发生变化〔18,19〕。活血接骨复方胶囊在临床中主要用于骨折、脱臼、软组织损伤、颈肩腰腿痛等多种疾病，具有消肿祛痛、壮骨接骨等功效。三七、血竭主要功效是活血、止血，活血化瘀，促进高凝状态血液重新开始流通，促进破裂血管闭合，起到止血作用〔20〕。Liu等〔21〕研究指出，通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路生物学活性，能减弱其对下游蛋白的作用，进一步将细胞自噬激活。本研究结果提示活血接骨复方胶囊能通过对细胞自噬进行调节，从而促进骨折愈合。