干扰ENST00000415026负调控miR-653增强小细胞肺癌对阿帕替尼的敏感性

李哲 柳志宝 孙震 李华蕊

(沧州市中心医院 1肿瘤内一科，河北 沧州 061000；2胸外科；3营养科)

肺癌是目前临床上最常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率较高，小细胞肺癌是肺癌的一种，虽仅占肺癌的20%左右，但其恶性程度高，更易发生转移〔1〕。虽然，小细胞肺癌患者对化疗和放疗有良好初始反应性，然而很多患者化疗后很快复发，耐药性是造成化疗失败的主要原因〔2〕。因此，克服小细胞肺癌的化疗耐药对临床治疗小细胞肺癌有重要意义。阿帕替尼是一种口服小分子抗血管生成剂，可抑制肿瘤血管生长；研究报道阿帕替尼对晚期一线或一线以上治疗失败的小细胞肺癌患者有一定的临床获益，安全性可控〔3，4〕，表明阿帕替尼治疗小细胞肺癌有良好效果，提高小细胞肺癌对阿帕替尼的敏感性能进一步提高其疗效。研究表明lncRNA可在转录中、转录后和表观遗传学水平上调控相关基因水平的表达，从而影响小细胞肺癌的增殖、侵袭、转移及化疗耐药〔5〕。王亚芳等〔6〕利用高通量lncRNA芯片技术分别检测发生转移和未转移的小细胞肺癌组织中差异表达的lncRNA，结果发现ENST00000415026在发生转移的小细胞肺癌组织中高表达；提示ENST00000415026可能参与了小细胞肺癌侵袭和转移的恶性表型；但其对小细胞肺癌阿帕替尼敏感性的影响及机制还尚不清楚。研究报道miR-653高表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡〔7〕。上调miR-653可抑制膀胱癌的生长〔8〕，表明上调miR-653可抑制肺癌及膀胱癌细胞的生长。但miR-653对小细胞肺癌阿帕替尼敏感性的影响尚不清楚。本研究旨在探讨ENST00000415026对小细胞肺癌阿帕替尼敏感性的影响及机制。

1 材料与方法

1.1一般临床资料 收集2018年1月至2020年1月河北省沧州市中心医院具有完整资料的26例小细胞肺癌和癌旁组织标本。其经病理检测为小细胞肺癌，患者手术前未进行手术及放化疗，距离癌组织边缘2～5 cm处切除的组织作为癌旁组织，所有患者同意且签署知情书。

1.2细胞与主要试剂 A549细胞购自上海泽叶生物科技有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；阿帕替尼购自美国Selleck公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8购自北京泰泽嘉业科技发展有限公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.3阿帕替尼耐药细胞的培养 A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中在37℃、5% CO2条件下常规培养，取对数生长期细胞，培养基中加入阿帕替尼培养，阿帕替尼起始浓度为0.001 μg/ml，刺激48 h后换新鲜培养基继续培养，选择存活细胞继续逐渐增加阿帕替尼浓度(0.010 μg/ml、0.100 μg/ml)进行培养，直到最后在1.00 μg/ml阿帕替尼浓度下能稳定存活，命名为A549/APA细胞。分别用0.001 μg/ml、0.010 μg/ml、0.100 μg/ml、1.000 μg/ml阿帕替尼刺激A549和A549/APA细胞，用CCK-8检测细胞存活率，进一步确定A549/APA细胞耐药，以正常培养的A549细胞作为对照组。

1.4细胞转染与分组 取对数生长期细胞A549/APA，将ENST00000415026干扰表达载体(si-ENST00000415026)及阴性对照(si-NC)转染至A549/APA细胞中，记为si-ENST00000415026组、si-NC组；将si-ENST00000415026分别与miR-653抑制剂(anti-miR-653)及阴性对照(anti-miR-NC)共转染至A549/APA细胞中，记为si-ENST00000415026+anti-miR-653组、si-ENST00000415026+anti-miR-NC组。

1.5CCK-8检测细胞存活率 选择不同浓度阿帕替尼刺激的A549和A549/APA细胞，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测细胞490 nm波长处的吸光度值(A)。细胞存活率(%)=实验组A值/空白对照组A值×100%。

1.6实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ENST00000415026和miR-653的表达水平 提取肺癌组织、癌旁组织及A549、A549/APA和各组细胞总RNA，反转录成cDNA后按照荧光定量试剂盒说明建立终体积为20 μl PCR体系(2 μl反转录产物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl无菌水)；PCR条件为95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；相对表达量用2-△△Ct计算。ENST00000415026和miR-653分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和U6为内参，ENST00000415026上游引物序列：5′-GACAGACCTCCAGCTTCCAG-3′，下游引物序列：5′-TTCAGAAGGACAGCCGAAGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-653上游引物序列：5′-TTCACTGGAGTTTGTTTCAAT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7流式细胞仪检测细胞周期 收集细胞，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，离心弃上清；然后重悬细胞，加入预冷的80%乙醇，4℃固定过夜；用PBS洗涤细胞3次，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃孵育30 min，加入PI染色液4℃染色15 min，上机检测激发波长488 nm处红色荧光，用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行分析。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，重悬后分别加入10 μl的Annexin V-FITC和加入5 μl PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9荧光素酶报告实验检测ENST00000415026和miR-653的靶向关系 StarBase预测显示ENST000 00415026与miR-653存在结合位点。构建ENST0 0000415026的野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-ENST00000415026和MUT-ENST00000415026，用LipofectamineTM 2000将其分别与miR-NC和miR-653共转染至细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.10Western印迹检测Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表达 提取细胞总蛋白并用BCA试剂盒进行定量。取50 μl蛋白样品于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5 %的牛血清蛋白封闭1 h；加入一抗4℃过夜，TBST洗膜3次；加入二抗室温培养1 h，再用TBST洗涤3次，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析各蛋白条带的灰度水平，蛋白表达水平=目的条带和GAPDH条带的比值。

1.11统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1APA对A549和A549/APA细胞活性的影响 与对照组相比，当阿帕替尼浓度≥0.100 μg/ml时A549细胞存活率显著降低(P<0.05)，而阿帕替尼浓度为1.000 μg/ml时A549/APA细胞存活率无显著变化(P>0.05,表1)；表明A549/APA细胞对阿帕替尼耐药，将其作为肺癌耐阿帕替尼细胞。

2.2ENST00000415026在肺癌中的表达 与癌旁组织(0.96±0.11)相比，肺癌组织中ENST0000 0415026表达水平(3.28±0.24)显著升高(P<0.05)；与A549细胞(3.39±0.11)相比，A549/APA细胞中ENST00000415026表达水平(4.54±0.14)也显著升高(P<0.05)。

2.3干扰ENST00000415026对A549/APA增殖凋亡的影响 与si-NC组相比，si-ENST00000415026组ENST00000415026表达水平显著降低，miR-653表达水平显著升高，G0-G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2-M期细胞所占比例无显著变化(P>0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图1，表2)。

表1 APA对A549和A549/APA细胞 存活率的影响

图1 干扰ENST00000415026对A549/APA 凋亡率的影响

表2 干扰ENST00000415026对A549/APA增殖凋亡的影响

2.4ENST00000415026靶向miR-653 StarBase在线软件预测显示ENST00000415026与miR-653存在结合位点(图2)。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC组相比，miR-653组中转染WT-ENST00000415026的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染MUT-ENST00000415026的细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05),表3。

2.5抑制miR-653可逆转干扰ENST00000415026处理A549/APA增殖凋亡的影响 与si-ENST0000 0415026+anti-miR-NC组相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653组miR-653、G0-G1期细胞所占比例显著降低，S期细胞所占比例显著升高(P<0.05)，G2-M期细胞所占比例无显著变化(P>0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，图3，表4。

表3 双荧光素酶报告实验

图3 抑制miR-653可逆转干扰ENST00000415026处理 A549/APA凋亡的影响

表4 抑制miR-653可逆转干扰ENST00000415026处理A549/APA增殖凋亡的影响

2.6Western印迹检测细胞中Ki67、Caspase-3蛋白表达 与si-NC组相比，si-ENST00000415026组Ki67表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)；与si-ENST00000415026+anti-miR-NC组相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653组Ki67表达水平显著升高，Caspase-3表达水平显著降低(P<0.05)，见图4，表7。

1～4：Si-NC组、si-ENST00000415026组、si-ENST00000415026+anti-miR-NC组、si-ENST00000415026+anti-miR-653组图4 Ki67、Caspase-3蛋白表达

表7 各组细胞中Ki67、Caspase-3蛋白表达

3 讨 论

小细胞肺癌恶性程度高，侵袭性强，进展迅速，临床以化疗和放疗为主要治疗手段，在放化疗失败后缺乏有效治疗手段，抗血管生成治疗在晚期小细胞肺癌中表现出一定疗效〔9〕；研究表明新型的抗血管生成剂阿帕替尼对标准治疗失败的晚期肺癌有明显疗效，且不良反应可控〔10〕。研究表明lncRNA参与调控肿瘤细胞化疗药物的耐药性与敏感性，研究其在肿瘤中的作用机制，可为提高化疗药物敏感性提供参考依据〔11〕。研究表明ENST00000415026在小细胞肺癌中高表达〔6〕；本研究结果表明ENST00000415026可能与A549细胞的阿帕替尼耐药性相关。Ki67是细胞核增殖抗原，抑制Ki67可抑制细胞增殖〔12〕；Caspase-3是细胞凋亡关键调控因子，Caspase-3高表达可诱导细胞凋亡〔13〕。表明干扰ENST00000415026可抑制A549/APA细胞增殖，促进细胞凋亡；干扰ENST00000415026可增强A549细胞对阿帕替尼的敏感性。

研究表明lncRNA可与miRNA相互作用参与恶性肿瘤的发生发展〔14〕。研究报道circ-RAD23B可通过miR-653-5p促进非小细胞肺癌细胞生长和侵袭〔15〕。沉默circ_0004771通过激活miR-653抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡〔16〕。表明miR-653高表达可抑制癌细胞生长，促进细胞凋亡。

综上，干扰ENST00000415026可能通过上调miR-653增强小细胞肺癌对阿帕替尼的敏感性。