声门上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1、miR-210表达与预后的关系

延青 杨花荣 王娜娜

声门上型喉癌约占喉癌的40%，是指发生于声带以上部位的实体肿瘤，手术结合放疗或化疗是其主要治疗方式，但治疗后患者往往存在复发等不良预后，因此，研究有效的预测生物标记物用于声门上型喉癌的诊疗及预后评估具有重要意义[1-3]。长链非编码RNA（Long chain non-coding RNA, LncRNA）可作为致癌或抑癌基因参与肿瘤细胞的增殖、迁移和转移，在喉癌诊断与治疗方面的应用成为当前研究的热点[4，5]。作为一种新发现的LncRNA，前列腺癌相关转录因子1（prostate cancer associated transcript-1，PCAT-1）参与多种癌症的发生发展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由15～24 个核苷酸组成的单链非编码RNA，广泛存在于真核细胞中，可参与机体多种生理和病理过程，具有作为血清标志物的潜力[6，7]。LncRNA 与miRNA 相互作用，是喉癌研究的一个新阶段，LncRNA PCAT-1 含有miR-210的结合位点，可能共同参与喉癌的发生发展，但其相互作用发挥调控的机制仍不清楚[5，7]。本研究通过检测声门上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平，分析其与患者临床病理特征及预后的关系，旨在初步探讨血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平在声门上型喉癌中的作用，为降低预后不良发生风险提供帮助。

资料与方法

1 一般资料

选取在本院就诊的声门上型喉癌患者120 例（选取时间为2013 年12 月～2017 年12 月）为观察组，平均年龄（57.53±5.85）岁，男/女为108/12 例，平均体质指数（BMI）为（19.98±5.43）kg/m2，T 分期：T1期83 例，T2 期37 例。将本组患者根据预后情况分为预后不良组21 例，男19 例，女2 例，平均年龄为（57.41±6.36）岁，BMI 为（19.82±5.25）kg/m2，T 分期：T1 期5 例，T2 期16 例；预后良好组99 例，男89例，女10 例，平均年龄为（57.65±6.52）岁，平均BMI为（20.14±5.63）kg/m2，T 分期：T1 期78 例，T2 期21例。另选择同期于本院进行体检的健康者120 例为对照组。

纳入标准：①所有患者均经喉部、颈部CT 及手术病理检查确诊为声门上型喉癌；②患者知情且随访资料完整。排除标准：①合并心力衰竭、心绞痛等心血管疾病者；②妊娠期妇女；③有家族精神病史或患有相关精神疾病的患者；④不能全程配合随访患者。本研究经本院道德伦理委员会批准。

2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 表达水平检测

所有研究对象于术前抽取静脉血10mL，离心（3000r/min）后提取血清。采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测血清中LncRNA PCAT1、miR-210 表 达 水 平。以 美 国Invitrogen 公司的RNA 提取试剂盒（货号15596-026）提取血清总RNA 和北京百奥莱博科技有限公司的逆转录试剂盒（货号ALH266-PTO）合成cDNA后进行qPCR 反应。反应体系共20μL：miScript SYBRRGreen Mix（货号218073，德国QIAGEN 公司）10μL，cDNA 4.0μL，上下游引物（10 μM）各1μL，ddH2O 4.0μL。LncRNA PCAT1 以GAPDH 作为内参，miR-210 以U6 作为内参，引物由EXIQON 公司合成。循环条件：92℃60s，1 个循环；95 ℃30s，56℃30s，72℃30s，40 个循环。采用2-ΔΔCT法计算血清中LncRNA PCAT1、miR-210 相对表达量。取3 次的平均值。

3 随访

所有患者均保留有完整的随访资料，以门诊与电话相结合的方式进行随访，平均随访时间36 个月，随访截止2020 年12 月，统计患者生存情况，其中生存99 例作为预后良好组，死亡21 例作为预后不良组。

4 统计学分析

运用SPSS 20.0 处理数据，P＜0.05 为差异有统计学意义。计数资料以n 表示，采用检验；计量资料以（±s）表示，采用t检验；采用Logistic 回归分析影响声门上型喉癌患者预后的因素；采用ROC 曲线分析血清LncRNA PCAT1、miR-210 单独及联合对声门上型喉癌患者预后的预测价值。

结果

1 两组血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比较

观察组血清LncRNA PCAT1 水平显著高于对照组（P＜0.05），miR-210 水平显著低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 观察组与对照组血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比较（±s）

表1 观察组与对照组血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比较（±s）

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2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平与声门上型喉癌病理参数的关系

以血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平平均值为界，高于其平均值为高表达，低于其平均值为低表达。血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平均与T 分期、淋巴结转移、分化程度有关（P＜0.05），见表2。

表2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平与声门上型喉癌病理参数的关系

3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平与预后的关系

根据随访情况将患者分为预后不良组21 例和预后良好组99 例，两组患者年龄、性别及BMI 比较差异无统计学意义（P＞0.05），预后不良组患者血清LncRNA PCAT1 水平显著高于预后良好组（P＜0.05），T1 期比例及血清miR-210 水平显著低于预后良好组（P＜0.05），见表3。

表3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平与预后的关系[（±s）或n]

表3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平与预后的关系[（±s）或n]

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4 声门上型喉癌患者预后不良的影响因素

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T 分期为T2 期、LncRNA PCAT1 高表达、miR-210 低表达均是影响声门上型喉癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

表4 影响因素分析结果

5 ROC 曲线分析血清LncRNA PCAT1、miR-210 对声门上型喉癌患者预后不良的预测价值

ROC 曲线分析结果显示，血清LncRNA PCAT1预测声门上型喉癌患者预后的曲线下面积为0.899（95% CI：0.784～1.000）（P＜0.001），截断值为1.601，敏感度为81.0%，特异性为98.0%。血清miR-210 预测声门上型喉癌患者预后的曲线下面积为0.764（95% CI：0.678～0.849）（P＜0.001），截断值为0.902，敏感度为90.5%，特异性为60.6%。血清LncRNA PCAT1、miR-210 联合预测声门上型喉癌患者预后的曲线下面积为0.925（95% CI：0.832～1.000）（P＜0.001），敏感度为81.0%，特异性为99.0%，见图1。

图1 ROC 曲线分析血清LncRNA PCAT1、miR-210对声门上型喉癌患者预后的预测价值

讨论

声门上型喉癌是指发生在声门上区（如会厌、室带、杓会厌襞等）的喉癌，发展较快，症状不明显，给患者和社会带来了巨大的健康负担，诊治可提高患者的生存率，复发和转移是影响预后的主要因素[8，9]。LncRNA 是一类非编码蛋白RNA 分子，在肿瘤发生发展中发挥复杂的生物功能。研究显示LncRNA 在喉癌等多种肿瘤中都存在异常表达或功能异常，有望成为喉癌诊断或评估预后的新型生物标志物[10，11]。LncRNA PCAT1 首先发现于前列腺癌中，参与机体基因组印记、转录激活与干扰等多种细胞生理过程，其表达水平与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系[10，12]。李艳莉等[12]研究表明，口腔鳞状细胞癌组织中PCAT1 表达水平显著高于癌旁正常组织。Hu 等[13]研究指出，PCAT1 可能是喉癌中一种新的癌基因，其表达水平在喉癌组织中明显上调。本研究中，声门上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1 水平较对照组高，且预后不良组血清LncRNA PCAT1 水平显著高于预后良好组，说明LncRNA PCAT1 可能参与肿瘤的发生以及进展，进而在声门上型喉癌的病情进展过程中发挥作用。

本研究显示血清LncRNA PCAT1 高表达是影响声门上型喉癌患者预后不良的独立危险因素，提示血清LncRNA PCAT1 可能作为预测声门上型喉癌患者预后不良的有效指标。本研究另绘制了ROC曲线，发现血清LncRNA PCAT1 预测声门上型喉癌患者预后不良的曲线下面积为0.899，截断值为1.601，敏感度为81.0%，特异性为98.0%，也进一步表明血清LncRNA PCAT1 水平对声门上型喉癌患者预后不良具有一定评估价值。

miRNA 是一类保守的非编码RNA，广泛参与机体细胞增殖、分化、生存和凋亡等调节过程，与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关，有希望成为临床上监测病情和预后的标志物[14，15]。miR-210 是一种研究广泛的miRNA，定位于人染色体11p15.5，与多种肿瘤患者的病情有关[15]何丹等[16]研究指出，miR-210 能够参与喉癌多药耐药的调控机制，其可通过调控其靶基因的表达影响喉癌的多药耐药性。研究表明，LncRNAs 可通过miRNA 调控途径在调节潜在活性和剪接事件中起着多种作用[11]。Hu 等[13]研究指出LncRNA PCAT-1 含有miRNA 的结合位点，喉癌组织中miR-210-3p 与LncRNA PCAT1 的表达水平呈负相关，LncRNA PCAT1/miR-210-3p 轴可能参与喉癌的发生发展。本研究中，声门上型喉癌患者血清miR-210 水平较对照组低，且预后不良组血清miR-210 水平显著低于预后良好组，表明血清miR-210 作为重要的调控因子可能在声门上型喉癌致病机制中承担重要角色。本研究结果显示，血清miR-210 低表达与声门上型喉癌患者预后不良有关，且ROC 曲线结果显示，血清miR-210 预测声门上型喉癌患者预后的曲线下面积为0.764，评估预后有一定价值。另本研究联合血清LncRNA PCAT1、miR-210 预测声门上型喉癌患者预后不良的曲线下面积为0.925，敏感度为81.0%，特异性为99.0%，提示二者联合检测对声门上型喉癌患者预后评估价值更高。推测LncRNA PCAT1、miR-210 可能通过影响肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程共同参与声门上型喉癌的发生发展及预后，今后需补充实验进行验证。

综上所述，声门上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1 水平升高，血清miR-210 水平降低，均对评估声门上型喉癌患者预后具有一定的价值，有望成为评估声门上型喉癌患者预后的潜在参考指标。但LncRNA PCAT1、miR-210 在声门上型喉癌发生发展的作用是一个复杂的过程，由于本研究的局限性，其具体作用机制需进一步研究。