鼻咽癌高癌家族中热休克蛋白70 的表达及意义*

谷婷婷 陈舒华 张文章 陈艳琼 刘湘 唐浩斌 农应全

中国是鼻咽癌高发区，根据国际癌症研究所发布的全球鼻咽癌数据资料，发现中国鼻咽癌居全球鼻咽癌发病的高位，男性高于女性。南方省份多发，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。治疗以放射治疗为主，鼻咽癌治疗失败多因放化疗抵抗、复发及转移。研究表明热休克蛋白70（HSP70）与鼻咽癌的放化疗抵抗、复发和转移密切相关。近年来，免疫治疗是一大热点，而热休克蛋白是免疫和靶向治疗的研究热点，其中热休克蛋白在鼻咽癌发生、发展及治疗过程中机制的研究较多。本课题组前期利用双向凝胶电泳技术（2-DE）和质谱分析方法，发现HSP70表达在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者>鼻咽癌高癌家系非癌成员>健康对照组,差异有统计学意义[1]。

鼻咽癌的发病与EB 病毒感染、遗传和环境因素有关。但较少探讨鼻咽癌的家族风险。鼻咽癌患者具有血缘关系的家族成员可能成为患癌的高危人群。然而，鼻咽癌家族成员的临床研究意义尚不十分清楚。Coghill 等[2]在台湾的一项研究中发现EBVgp350 是鼻咽癌高癌家系成员的保护因子，能降低其患鼻咽癌的风险，但gp350 抗体水平对普通人群的鼻咽癌患病率没有明显作用。Liu 等[3]对2010～2014 年进行了大样本基于人群的病例对照研究，发现具有一级鼻咽癌家族史（鼻咽癌病人的父母、兄弟姐妹、子女）的个体与无鼻咽癌家族史的个体相比，患鼻咽癌的风险高四倍以上，但患其他恶性肿瘤风险无差异性，得出有鼻咽癌家族史的个体发生鼻咽癌的风险要高得多。这些发现可以指导鼻咽癌高发人群早期检测和临床咨询策略的制定。有鼻咽癌家族史的人群为患鼻咽癌的高危人群。本实验着重研究高癌家族史鼻咽癌患者的HSP70 蛋白的表达特征，探索HSP70 蛋白与鼻咽癌高癌家族成员患病风险的关联性。

资料与方法

1 研究对象与取材

入组标准：鼻咽癌高癌家系是指患者直系亲属中有3 个以上成员确诊患癌症，其中2 个以上为鼻咽癌。设立鼻咽癌高癌家系癌患者组（高癌组）、散发鼻咽癌患者组（散发组），患者均经病理诊断为确诊未分化型非角化性鼻咽癌，并均未经过放化疗；健康对照组（正常组）为同期体检中心健康人员。入组人员基本为佛山居民，均为在佛山市第一人民医院头颈放疗科与佛山市第二人民医院耳鼻咽喉科确诊为鼻咽癌的患者，其中高癌组与散发组各为20例，正常组20 例，所有观察者留取外周静脉血标本4ml 备用。排除标准：妊娠期妇女，年龄超过80 岁者，同时患有其他癌症或有其他严重基础病、多器官功能障碍患者，鼻咽癌复发患者。三组在年龄、性别、地域、标本获取时间等方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1主要试剂

RNA 提取试剂盒为QIAGEN 公司RNeasy mini kit74104 试剂盒。逆转录试剂盒为Thermo 公司RevertAid First strand CDNA synthesis kit#1622。real-time PCR 试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司DRR420A SYBR Premix Ex Taq。PCR 引物为奥科鼎盛生物科技有限公司合成。BCA 定量试剂盒为Solarbio。兔抗人HSP70 与兔抗人β-acin 均为Abcam 公司抗体二抗。为Thermo 公司生产的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG。

2.2外周静脉

血单个核细胞的制备：初治鼻咽癌患者入院第二天晨起用EDTA 抗凝管抽取外周血4ml，迅速颠倒混匀，防止血液凝固。4h 内用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，-80°冰箱保存备用。

2.3Western blot 检测HSP70 蛋白表达的水平

用RIPA 裂解液冰上裂解外周血单个核细胞30min 后，BCA 法检测并计算总蛋白浓度，凝胶每孔上样40μg 蛋白后于BIO-RAD 垂直电泳系统分离目的蛋白，BIO-RAD 半干转膜仪电转30min。以1∶3000 稀释的HSP70 及1∶5000 稀释的β-acin 抗体-4℃孵育过夜，以1∶5000 稀释的HRP 标记羊抗兔lgG（H+L）二抗结合一抗，ECL 发光液检测蛋白相对表达量。

2.4RT-qPCR

在无菌通风条件下按RNeasy mini kit74104 试剂盒说明书提取外周血单个核细胞中总RNA，置于冰上，美国Thermo fisher 公司的NanoDrop 2000/2000c 紫外可见分光光度计检测总RNA。OD260/OD280 在1.9 到2.1 之间者为合格品。将不同样品稀释至相同浓度，取1μl 于电泳槽内跑RNA 胶，RNA未降解样品继续用于逆转录。以500ng 总RNA 为模板，按逆转录试剂盒RevertAid First strand CDNA synthesis kit#1622 说明书配置逆转录反应体系，采用随机引物法反转录细胞内mRNA，使之成为cDNA。反转录完成后，用2μL cDNA 配制Real-time PCR体系，引物序列为F：TgACTgTgTTgTTTCggTTC；R：TggTTTCTCTTCTAAgCgAgg。按SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书配制反应体系。参照说明书设置反应条件，扩增靶基因检测转录产物。

3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。Western blot 灰度分析时，为使不同凝胶电泳组的结果更具有可比性，统一将同组蛋白相对含量的最大值标准化为1，检验标准取=0.05，当P<0.05 时认为差异具有统计学意义。首先用K-S 进行正态性检验，符合正态分布，采用单因素方差分析，Levene 方差齐性检验，方差不齐，选择基于方差不齐的Welch法,多重比较选择基于方差不齐的Dunnett’s T3 法；方差齐，用ANOVA 法，多重比较选择基于方差齐性的LSD 法。计量数据用均数±标准差（±s）表示。

结果

1 HSP70 Real Time PCR 结果

HSP70 mRNA 在高癌组、散发组、正常组外周血单个核细胞中的2-△△Ct分别为-14.071±2.408；-13.952±2.726；-13.905±1.601。差异无统计学意义（P=0.970）。（图1）

图1 患者外周血单个核细胞中HSP70 mRNA 的相对定量表达

2 HSP70 蛋白在人外周血单个核细胞中的表达

HSP70 蛋白在高癌组、散发组、正常组外周血单个核细胞中的蛋白表达分别为0.648±0.292；0.490±0.314；0.395±0.165，差异有统计学意义（P=0.007）。两两比较，高癌组与正常组比较，差异有统计学意义（P=0.006）；散发组与正常组比较，差异无统计学意义（P=0.552）；高癌组与散发组比较，差异无统计学意义（P=0.285）。（图2）

图2 患者癌外周血单个核细胞中HSP70 蛋白的相对表达

图3 外周血单个核细胞中高癌组、散发组与正常组蛋白水平变化

讨论

我国南方是世界鼻咽癌高发地区，鼻咽癌发病部位隐匿，早期无明显临床症状，故临床上容易被漏诊。鼻咽癌（NPC）是一种高危头颈癌，临床晚期疗效差，但早期疗效良好，早期放化疗5 年生存率可达70%以上。鼻咽癌局部复发和远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因。HSP70 与放化疗抵抗相关，Qi等[4]研究表明HSP 70 蛋白结合多模态MRI 可以准确评价晚期宫颈癌患者的放射治疗效果。HSP70 蛋白表达低表达的患者宫颈癌复发明显减少，为宫颈癌的预防、诊断和预后评估提供了潜在的参考指标。Wang 等[5]通过鼻咽癌数据库比对，得出HSP70的甲基化可能与鼻咽癌预后差有关，可作为鼻咽癌预后评估的生物标志物。HSP70 蛋白的表达在鼻咽癌发生、发展中发挥重要作用，可作为鼻咽癌新的诊断或预后评估和候选治疗靶点[6]。

Cai 等[7]通过免疫组织化学方法发现，HSP70 在507 个鼻咽癌患者的肿瘤组织的细胞核、膜和细胞质中的表达不同。Kaplan-Meier 生存分析表明，不同的HSP70 表达模式也与患者预后相关。高膜性和细胞质水平的HSP70 预测患者生存期良好。相比之下，HSP70 核丰度与低生存率相关，提出HSP70 的表达对鼻咽癌具有一定的预后预测价值，HSP70 不同的空间丰度可能暗示了其在鼻咽癌发展中的重要作用，为鼻咽癌免疫治疗提供了思路。Feng 等[8]通过Kaplan-Meier 分析发现HSP10 和HSP70 阳性表达的鼻咽癌患者生存率显着低于阴性表达患者，Cox回归分析显示HSP10 和HSP70 蛋白的阳性表达提示为鼻咽癌患者预后不良的因素。廖秋玲等[9]发现血清HSP70 含量在鼻咽癌组与正常对照组、鼻咽癌淋巴结转移组与无淋巴结转移组之间差异均有统计学意义，HSP70 水平在不同TNM 分期中差异有统计学意义,随着TNM 分期的提高,其血清水平逐步提高，HSP70 的表达随着鼻咽癌的发展逐渐增强,可能反映鼻咽癌的进展趋势。动态检测鼻咽癌患者血清HSP70 的水平,可作为鼻咽癌诊断的一个重要指标,有一定的临床价值。

遗传因素方面，Xu 等[10]发现在鼻咽癌患者，婚姻状况对生存结果的影响中，只有非西班牙裔、白人和华裔鼻咽癌患者才能从已婚状态中获得生存利益。单身和丧偶患者被视为高危人群。Mokni-Baizig 等[11]调查了突尼斯人鼻咽癌患者及其家属的人类白细胞抗原（HLA）谱，以及健康的突尼斯人的样本，以确定与家族性鼻咽癌相关的特异性HLA；发现HLA-A*26 可能是一个诱导指标，其等位基因频率在鼻咽癌患者中明显高于对照组（P=0.003）和鼻咽癌患者中的高危家庭成员（P=0.067）。多因素Logistic 回归分析显示HLA-A*26 和HLA-A*30 相互关联，对鼻咽癌的危险性有重要影响，从而得出HLA-A*26-A*30 可能是突尼斯高危家族鼻咽癌筛查的预测指标的结论。陈舒华等[12]发现CAPZA1 低表达可能是高癌家系鼻咽癌高发的之一，外周血单核细胞CAPZA1 也行可作为鼻咽癌的其中一个生物标志物。感染Epstein-Barr 病毒（EBV）的个体容易发生鼻咽癌。Liu 等[13]研究了来自台湾的480 个NPC 患者和1291 个NPC 患者的兄弟姐妹，从调查问卷中得出了家庭内出生顺序的信息；运用Logistic回归模型研究了出生顺序与NPC 之间的关系，观察到，对于高发NPC 家族，年长的兄弟姐妹具有更大的患病风险。鼻咽癌的流行病学研究已经比较深入，但有鼻咽癌家族史患者的蛋白质方面的研究尚在起步阶段。

高危家族遗传学研究相对偏少，而遗传易感因素是鼻咽癌发病的内在基础，通过研究遗传相关基因，对高危人群进行相关基因的修饰也许能改善高癌家族人群的患病风险。因此，本课题组致力于研究高癌家族人群中差异表达的蛋白质。本课题组前期利用双向凝胶电泳技术（2-DE）和质谱分析方法，发现HSP70 表达在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者>鼻咽癌高癌家系成员>健康对照组, 差异有显著性；并且发现鼻咽癌高癌家系气虚体质鼻咽癌患者组和湿热体质鼻咽癌患者鼻咽病灶组织存在不同的蛋白质表达谱，筛选鉴定了HSP70 等5 个差异表达蛋白质[14]。而本实验主要研究了HSP70 在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者中的表达特性，通过WB 及PCR 发现HSP70 蛋白在高癌组、散发组、正常组外周血单个核细胞中的蛋白表达分别为0.648±0.292；0.490±0.314；0.395±0.165，差异有统计学意义（P=0.007）。两两比较，高癌组与正常组，差异有统计学意义（P=0.006）；HSP70mRNA 在高癌组、散发组、正常组外周血单个核细胞中的表达差异无统计学意义；结果提示HSP70 的表达可能主要影响中心法则中转录后修饰的过程，而这一过程可以做为后期靶向治疗的研究方向，为鼻咽癌的治疗靶标选择提供一定的参考。鼻咽癌相关的标志物研究不断进入我们的视野，EB 病毒检测是我国鼻咽癌筛查的主要方法，哪种标志物能够协同或者超越EB 病毒检测，成为鼻咽癌的早期检测标志物，尚需要时间开展深入研究，希望我们的研究能为鼻咽癌未来的诊断及治疗方面提供一定的参考。