miR-146a-5p、miR-23a-3p 与阿尔茨海默病及认知功能障碍的相关性

马玉柱，邹文静

阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统和退变性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征，认知功能的缺损往往会涉及记忆、学习、执行等多个认知域。微小核糖核酸（miRNA）在神经细胞分化、凋亡、增殖等生物学过程中发挥了广泛而重要的作用。miRNAs 参与可塑性的调节，并与记忆和学习有关，作为AD认知功能的风险预测因子具有巨大潜力[1]。研究推测海马中特异性miRNA 表达可作为一种中介机制参与突触功能的损害过程，使脑代谢和脑电生理活动发生改变，引发认知功能障碍[2]。miR-146a 是神经系统疾病中一种重要的免疫调节因子，在固有免疫和神经免疫中均发挥着重要作用，可参与AD 疾病的神经炎症过程[3]。有研究认为miR-23a 表达与炎症反应的作用有密切联系，但对于miR-23a 是否参与了AD 的炎症机制尚无报告[4]。本研究分析miR-146a-5p、miR-23a-3p 与AD 认知功能障碍的相关性及对神经炎症的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江中医药大学附属杭州市中医院2019 年1 月至2021年1 月收治的轻度认知障碍（MCI）与AD患者各50 例，设为MCI组和AD组。MCI组男31 例，女19 例；年龄64～82岁，平均（73.3± 9.8）岁；文化水平：小学15 例，初高中及中专26 例，大专及本科9 例。AD 组男28 例，女22 例；年龄60～81 岁，平均（71.9±9.3）岁；文化水平：小学16 例，初高中及中专26 例，大专及本科8 例。另纳入同期到本院体检的健康老年人群50 例设为对照组，其中男29例，女21 例；年龄63～80 岁，平均（71.6±9.3）岁；文化水平：小学17 例，初高中及中专25 例，大专及本科8 例。3 组性别、年龄、文化水平差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审核通过。

1.2 入选标准 纳入标准：年龄＞60岁；临床资料完整，能够配合完成各项检查；未曾服用影响认知功能或激素类药物；无内分泌系统疾病史；家属签署研究知情同意书。排除标准：存在既往精神疾病史，如抑郁症、精神分裂症等；具有颅脑损伤史；合并高血压、糖尿病等慢性全身疾病史。

1.3 miR-146a-5p、miR-23a-3p 检测抽取受试者入院后静脉血3～4 ml，于4 ℃下12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液分装至EP 管中，－80℃冻存。取出冻存样本室温下自然解冻，取200l血浆样本至另一个新EP 管中，加入900l裂解液MZA震荡混匀30 s，室温下放置5 min。加入200l 氯仿震荡15s，室温下放置5 min。EP 管于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液置于新EP 管中，加入2 倍乙醇混匀，弃上清，室温下静置2 min，12 000 r/min 离心30 s，加入500l乙醇的蛋白液MRD，室温下静置2 min，12 000 r/min 离心30 s，弃上清，在加入500l乙醇的漂洗液RW，室温下静置2min，12 000 r/min 离心30 s，弃上清。处理后室温下12 000 r/min 离心2 min，弃上清，通风挥发乙醇。用新的离心管滴入30l RNase-Free ddH2O，室温静置2 min，12 000 r/min 离心2 min，获得洗脱缓冲液。获取洗脱缓冲液后重复上一步骤获取缓冲液RNA。应用紫外分光光度计NanoDrop 2000 测定RNA 纯度。混匀后取适量管壁液体置于聚合酶链式反应（PCR）管中，加入反应液（2×miRNA RT Reaction Buffer 10l、Total RNA 8l、miRNA RT Enzyme Mix 2l）混匀，1 500 r/min 离心。应用ABI 的TaqMan Micro-RNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，获得cDNA。反应维度及时间为42 ℃60 min，95 ℃3 min。在PCR 板置于冰上进行PCR 反应，反应液配制：2×miRcute Plus miRNA 10l、ddH2O 5.2l、50×ROX Reference Dye 2l、miRNA 第 一 链cDNA 2l、Reverse Primer（10mol/L）0.4l、Forward Primer 0.4l。应用ABI公司的Step one plus PCR System 荧光定量仪器进行PCR 反应，反应条件：95 ℃15 min 1 个循环；94 ℃20 s、64 ℃30 s、72 ℃34 s 5 个循环；94 ℃20 s、60 ℃34 s 45 个循环。完成后进行荧光数据采集。表达量计算：F=2－△△Ct。miR-146a-5p 引物 序 列 5’-TGCGCTGAGAACTGAATTCCAT-3’；miR-23a-3p 引物序列5’-CCTACATCGCACCGGAGTCTG-3’；以U6 为内参，引物序列：5’-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3’[5-6]。引物购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 观察指标（1）认知功能：采用简易精神状态评价量表（MMSE）[7]和改良版蒙特利尔认知评估量表（MoCA）[8]评估受试者认知功能。MMSE 量表包含5个部分，满分30 分，≥25 分为认知正常，21～24 分为轻度认知障碍，18～20 分为中度认知障碍，≤17 分为重度认知障碍。MoCA 量表包含命名能力、注意力与计算力、语言功能、定向力、抽象思维能力、延迟回忆、空间功能与执行能力。满分30 分，受教育年限＜12 年另+1 分，＜26 分即定义为认知功能损害，分数越低，认知功能损害越严重。（2）炎症因子：抽取受试者入院后静脉血3～4 ml，3 000 r/min 离心处理5 min，分离血清于试管中，－20℃冻存待检。采用ELISA法检测C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-）水平。（3）miR-146a-5p、miR-23a-3p 表达。（4）分析MMSE、MoCA 评分与miR-146a-5p、miR-23a-3p 表达的相关性。

1.5 统计方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率（%）表示，采用2检验。相关性采用双变量Pearson直线相关分析。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 认知功能 3 组MMSE评分、MoCA评分差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中AD 组＜MCI 组＜对照组（均P ＜0.05），3 组miR-146a-5p 和miR-23a-3p表达量差异均有统计学意义（均P ＜0.05），miR-146a-5p 表达量：AD 组＜MCI 组＜对照组，miR-23a-3p 表达量：AD组＞MCI组＞对照组（均P＜0.05）。见表1。

表1 3 组认知功能、miR-146a-5p、miR-23a-3p 比较

表2 3 组炎症因子水平比较

2.3 MMSE、MoCA 评分与miR-146a-5p、miR-23a-3p 相关性 MMSE、MoCA评分与miR-146a-5p表达量呈正相关（r=6.258、6.640，均P＜0.05），与miR-23a-3p表达量呈负相关（r=－6.027、－5.874，均P ＜0.05）。

3 讨论

研究发现，小胶质细胞活化与神经炎性反应在AD的发生发展中发挥着重要作用[9]。正常情况下，小胶质细胞在脑内处于静息状态，在受到刺激后，小胶质细胞迅速活化，可产生IL-1、IL-6、TNF-等一系列的炎症因子，引发中枢神经系统炎症级联反应。郭敏等[10]研究指出脑内促炎因子增多时，可通过激活不同细胞的信号转导通路、长时程增强效应、干扰突触可塑性等机制参与认知功能损害。亢涛[11]研究指出AD 患者体内存在大量的炎症因子表达。本研究显示，AD组CRP、IL-1、IL-6、TNF-水平高于MCI 组和对照组，这说明炎症反应参与了AD 的发生发展。

miRNA在神经系统中大量表达，具有特异性、区域性、时效性等特点，对神经元分化、脑组织的发育及高级神经功能具有重要的调节作用[12]。本研究显示，AD 组miR-146a-5p 表达量低于MCI 组和对照组，miR-23a-3p 表达量高于MCI组和对照组，这说明 miR-146a-5p、miR-23a-3p 可能参与了AD患者的认知损害机制。经相关性分析显示，MMSE、MoCA 评分与miR-146a-5p 表达量呈正相关，与miR-23a-3p 表达量呈负相关，进一步明确以上两种基因参与认知功能损害的可能。

在神经系统疾病中，miR-146a 被认为是重要的神经免疫调节因子，炎症因子作为免疫细胞之间的化学信使，能够通过神经内分泌激素代谢和修饰神经递质，从而影响神经发育和行为变化。陈芳荣等[13]研究指出，miR-146a-5p可通过对TRAF6 基因表达的抑制作用抑制炎症反应。研究认为miR-146a-5p 作为一种调节细胞因子受体信号通路和Toll样受体（TLR）信号通路的内源性调节因子，可通过级联信号的放大作用抑制炎症因子的表达，进一步诱导免疫及抑制炎症反应。此外，在炎症反应中，miR-23a的表达下调，可通过上调其靶基因从而抑制NF-xB 的过度活化，防止IL-1、IL-6、TNF-等促炎因子的过度表达进一步对神经造成损害。赵永杰[14]研究指出，miR-23a可能通过靶向NF-kB信号通路抑制基因发挥作用。这也是从miRNA的角度更明确地解释了机体在免疫应答中存在一种负反馈调节机制[15]。由此可知，胶质细胞与神经炎症级联反应密切关联，因此研究分析miR-23a-3p 与NFkB 信号通路发挥炎症反应可影响中枢神经中胶质细胞的增生及突触重建，从而损害AD 患者的认知功能。