精子线粒体膜电位在宫腔内人工授精的综合评估作用

戎春浩，周黎明，李燕

宫腔内人工授精（IUI）是通过体外优化处理精子并以非性交的方式注入女性宫腔，使精卵自然结合，从而达到受孕的目的，其与其他的辅助生殖技术（ART）相比，是一种成本更低且侵入性伤害更小的治疗不孕不育的方法[1]。但IUI 的成功率却不如其他ART 助孕方式高，总体成功率约15%[2-3]，其中男性精子质量问题是重要因素。精子的授精能力取决于精子的质量和内在功能，目前临床上还是以传统的精液参数作为ART治疗前的男性精子质量评估指标，如射精量、精子浓度、精子总数、精子总活动率、精子前向运动率、精子不活动率、精子DNA 碎片指数及精子正常形态率等。有研究表明，精子质量与IUI成功率之间存在着相关性，较高的精子正常形态率及活动率是IUI 成功的关键因素[4]。但在ART 治疗中，由于男性精子功能缺陷，有5%～10%的治疗周期会发生授精失败[5]。

有研究发现，精子线粒体能量的储存与细胞膜上的质子浓度和电位差有关[6]，因此可以通过对精子线粒体膜电位（MMP）的分析，评估精子能量水平和受精能力。精子MMP 完整性不仅反映精子线粒体的能量状态，还与精子活动能力密切相关，其是反应精子功能的一个重要指标，近几年越来越受到关注。本研究以每一进入IUI周期的临床妊娠率作为最终评估指标，探讨MMP对IUI妊娠结局的预测价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020 年6 月至2021 年8 月在宁波市妇女儿童医院生殖中心行IUI治疗的不孕不育夫妇的临床资料。纳入标准：（1）女方年龄＜40岁；（2）男方年龄＜45 岁；（3）无卵巢功能减退；（4）女方基础卵泡刺激素水平正常（＜11 IU/L）；（5）女方输卵管通畅及无排卵障碍、子宫内膜异位症；（6）女方排除盆腔炎症和生殖内分泌异常等潜在的不孕因素；（7）夫妻双方均无染色体异常、性病等。根据男方精子MMP 的检测结果，将研究对象分为低MMP 组（≤52%）和高MMP 组（＞52%）。本研究所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 精液常规分析 男方禁欲2～7d后，通过手淫法采集精液样本于无菌容器内，根据《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5 版[7]标准方法进行分析，测定一次射精量，用计算机辅助精子分析仪（北京穗加SSA-II）检测精子精子浓度、总数、总活动率、前向运动率及不活动率等。

1.2.2 精子形态分析 采用改良巴氏染色法（华康公司，深圳）对样本进行涂片、染色，按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5 版形态学判读标准计数。油镜下至少计数200 条精子，读取2 张玻片，正常形态率=（正常形态精子数/精子总数）×100%。

1.2.3 精子染色质结构分析试验 应用精子核完整性染色试剂盒（星博公司，浙江），严格按产品说明书操作，对精子进行吖啶橙染色，其中天然双链DNA呈绿色荧光，单链DNA 呈红色荧光，荧光信号通过流式细胞仪（BD-Calibur）进行分析，计算得出精子DNA 碎片指数。

1.2.4 精子MMP 检测 参照精子中段线粒体染色试剂盒说明书（星博公司，浙江），用PBS 调整精子浓度1×106/ml，采用荧光染料JC-1 进行染色，荧光信号通过流式细胞仪（BD-Calibur）进行检测，计算得出精子MMP 值。

1.2.5 IUI 助孕方案及临床妊娠率统计女方患者通过克罗米芬（CC）或促性腺激素（HMG）促排卵，B超、血尿LH峰值等方法综合评估监测卵泡生长发育，在平均卵泡直径＞16 mm时，肌注HCG 1 000 U，36 h 后行IUI。受精方法：女方截石位，清洗会阴、消毒，采用双腔导管将上游精子悬液缓慢注入宫腔，授精量为0.5～2ml，术后保持仰卧位15～20min。术后14d测血清-hCG含量，若≥25IU/L，且4周后阴道超声检查观察到宫内孕囊和胎心搏动，则确定为临床妊娠。在临床妊娠12 周内发生妊娠丢失则为早期流产。

1.3 统计方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析或t 检验；计数资料采用2检验；相关性分析采用Spearman分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基本资料比较 本研究共纳入329 个IUI助孕周期，其中低MMP组共205 个周期，高MMP 组共124 个周期。两组女方年龄、BMI 指数、AMH、男方年龄及禁欲天数差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。见表1。

表1 两组基本资料比较

2.2 两组精液参数及临床妊娠结局比较 高MMP 组的精子浓度、精子总数、精子总活动率、精子前向运动率及正常精子形态率均高于低MMP组（均P＜0.05）。低MMP 组的精子不活动率和精子DNA碎片指数均高于高MMP组（均P＜0.01）。两组射精量差异无统计学意义（P ＞0.05）。高MMP 组的IUI 临床妊娠率高于低MMP 组（P ＜0.01）。见表2。

表2 两组精液参数及临床妊娠结局比较

2.3 MMP与传统精液参数的相关性分析 MMP 与精子浓度、精子总数、精子总活动率、精子前向运动率及正常精子形态率均呈正相关（均P＜0.01）；MMP与精子不活动率及精子DNA 碎片率呈负相关（均P＜0.01）；MMP与一次射精量无关（P ＞0.05）。见表3。

表3 MMP 与传统精液参数的相关性分析

3 讨论

本研究结果显示高MMP 组IUI 临床妊娠率高于低MMP 组。高MMP 组和低MMP 组的精子浓度、精子总数、精子总活动率、精子前向运动率、精子不活动率、正常精子形态率和精子DNA碎片指数差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。精子MMP 与精子浓度、精子总数、精子总活动率、精子前向运动率、正常精子形态率呈正相关，与精子不活动率、精子DNA 碎片指数呈负相关。这表明精子MMP 水平与精子数量减少、精子运动能力下降、精子畸形率增加、DNA 碎片指数上升及IUI 临床妊娠率降低有关，其是重要的精子功能评估指标。精子MMP 水平检测联合传统精液参数有助于综合评估男性不育。

IUI 助孕方式一直是治疗男性因素引起不孕的主要方法之一，相比体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射技术（ICSI），其操作简单、费用少及侵袭性更弱，但是妊娠成功率只有15%～20%[8]。实验室精液常规参数分析一直是评估男性生育力的常规检查，也是作为男性不育患者是否适合做IUI 的判断依据。但是近几年来，越来越多的学者提出仅仅通过传统精液基本参数来评估男方的生育力水平是不够的，David 等[9]研究发现仅仅通过传统的精液参数对宫腔内人工授精结局的预测无法达到预期效果，精子内在的功能缺陷也会对生育力产生影响。

精子从睾丸生成到附睾里成熟需要经过一系列动态变化，发育过程中其他细胞器和细胞质会逐渐消失。线粒体从最初的大约103 个线粒体减少到80 个[10]。当精卵结合发生时，精子线粒体会通过自噬途径被完全降解清除[11]。精子线粒体参与氧化磷酸化并合成ATP，为精子运动提供主要的能量来源；维持钙离子稳态；参与类固醇激素的生物合成；发生氧化应激反应，产生ROS；通过“固有”凋亡途径调控精子凋亡，维持男性生育力；维持精子顶体酶活性、顶体反应和染色质完整性，直接影响精子的受精能力[12]。

MMP是指在精子能量代谢过程中，电子经呼吸链传递产生ATP，同时复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ将质子从线粒体内膜基质侧泵至内膜外所形成的跨膜电位差。在正常的精子线粒体中，跨膜电位差反映了电子传输和氧化磷酸化的过程，该过程驱动线粒体ATP 的产生。因此，MMP是反映精子线粒体功能的完整性。而线粒体最显著的功能就是以ATP 形式产生化学能，精子利用这些能量从而维持活动能力，这是男性生育能力的主要决定因素之一。Gallon 等[13]发现MMP 低的精子，精卵结合发生顶体反应的能力较差，使精子不易通过卵丘透明带，继而发生受精障碍。MMP 反映了精子线粒体的功能完整性和能量状态，如果MMP降低就会直接影响精子的质量和功能，从而导致男性不育的发生[14]。而另一项研究表明，精子线粒体膜电位的改变，可以预测精子的授精能力，精子线粒体膜电位越高，精子的授精能力越强[15]。本研究数据也证实了这一点，精子MMP越高精子活动能力越强。Marchetti 等[16]以传统实验室精液参数精子活动率和精子MMP 水平为依据，对91 例ART 助孕周期的分析以及受精成功组和失败组的比较，发现精子MMP检测更优于传统精子活动力检测对受精结局的预测。也有学者提出精子MMP和精子DNA碎片指数联合预测女性配偶自然受孕的能力优于精液传统参数[17]，是临床评估特发性男性不育的重要指标[18]。所以，对于行IUI助孕方式的男性不育患者来说，精子MMP检查是十分有意义的，可以提前评估出低授精能力的精液样本，做到IUI风险预估，必要时可以改变ART助孕方式来确保良好的结局。