hsa-miR-34a在肿瘤中的表达及生物信息学分析

文舒展， 付子乐， 陈淑英

（1.复旦大学附属华山医院骨科，上海 200040；2.复旦大学附属中山医院肝外科，上海 200032；2.复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

微小RNA（microRNA，miRNA）是长度约22 nt的非编码RNA，在后生动物和植物基因的转录后调节中起关键作用[1]。miRNA由非外显子区域基因组转录，成熟后可与目标信使RNA（messenger RNA，mRNA）结合，与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上可抑制其靶mRNA表达（在哺乳动物中比较普遍），或影响mRNA的稳定性，引起靶mRNA的降解（在植物中比较常见）[2]。在许多重要的生物学过程中都有miRNA的参与，如细胞增殖和凋亡、血细胞发育、炎症细胞激活、神经发生、胎儿发育[2-3]。人微小RNA-34a（homo sapiens microRNA-34a，hsa-miR-34a）被认为是肿瘤抑制的主要调节因子，在许多肿瘤中表达缺失或降低[4]，通过miR-34a再表达治疗肿瘤已成为一个重要的研究方向。本研究通过生物信息学方法预测hsa-miR-34a的靶基因，采用功能富集、信号通路富集、蛋白质相互作用分析等方法对其进行分析，结合miR-34a在肿瘤中表达的变化，以期能进一步分析hsa-miR-34a在肿瘤发生、发展中的作用，为后续的临床和基础研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 资料收集

在Pubmed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、Web of science（https：//www.webofscience.com/wos/alldb/basic-search）、OVID（https：//ovidsp.dc2.ovid.com/ovid-a/ovidweb.cgi）数据库进行文献搜索，文献检索主题词：“hsa-miR-34a”“microRNA”“cancer”“bioinformatics analysis”“GO”“enrichment analysis”，对检索到的文献进行归纳整理，分析hsa-miR-34a在不同类型肿瘤中的表达变化。

1.2 miRNA同源性分析

采用UCSC Genome Browser（http：//genome-asia.ucsc.edu/index.html）对hsa-miR-34a对应基因组在人染色体上的位置进行定位，使用miRBase在线工具（http：//www.miRbase.org）检索获得不同物种中miR-34a的染色体定位和碱基序列，通过比对获得同源保守序列。

1.3 靶基因预测

分别通过TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、miRDB（http：//www.miRdb.org/）、miRWalk（http：//miRwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和mirDIP（http：//ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp）4个数据库获得hsamiR-34a的靶基因预测结果，取4个预测结果的交集，以mirDIP数据库的数据为参照标准，采用Target Score功能进行排序，筛选前30个基因作为预测靶基因集。

1.4 靶基因表达分析

利用TiGER数据库（http：//bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/）获得靶基因集合在正常人体不同组织和器官中的表达情况。采用Graphpad Prism 8.0软件对数据进行可视化分析，采用单因素方差分析进行统计分析。

1.5 靶基因功能与通路富集分析

利用PANTHER（http：//pantherdb.org/）和DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在线工具对靶基因集进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和REACTOME通路富集分析。

1.6 蛋白质互作分析

将预测靶基因对应的蛋白质名称录入STRING数据库（https：//string-db.org/），得出靶基因对应蛋白质的相互关系网络图。

1.7 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件对靶基因表达数据进行可视化分析，采用单因素方差分析进行统计分析。采用Fisher精确概率法统计通路富集分析数据。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa-miR-34a在不同肿瘤中的表达情况

文献检索结果显示，乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等肿瘤中hsa-miR-34a表达显著降低，见表1。

表1 不同肿瘤中hsa-miR-34a的表达情况及作用

2.2 hsa-miR-34a同源性分析结果

通过miRBase、UCSC Genome Browser分析得到hsa-miR-34a对应基因组定位于人染色体1p36.22[9151668-9151777]，长度为110 bp，序列号为MI0000268。分析小鼠、猕猴等不同物种的miR-34a，发现“UGGCAGUGU”序列在不同物种间高度保守。见表2。

表2 不同物种中miR-34a的保守序列

2.3 hsa-miR-34a的靶基因预测结果

采用TargetScan、miRDB、miRWalk和mirDIP数据库预测hsa-miR-34a的靶基因，分别得到靶基因数量为754、899、7 345、1 399个，取交集后得到225个靶基因，然后采用Target Score功能排序，选取前30个靶基因作为后续分析的靶基因集合，分别为：MDM4、DLL1、RAP1GDS1、FAM167A、HCN3、SDK2、FAM76A、E2F5、FKBP1B、PPP1R11、SCN2B、MGAT4A、NAV3、SYT1、SATB2、CELF3、XYLT1、MET、MYCN、PACS1、NAV1、CACNA1E、LGR4、TGIF2、VAMP2、FUT9、PKP4、RRAS、ABR、MSR1。

2.4 hsa-miR-34a靶基因的表达

采用TiGER数据平台分析靶基因集在人体各组织器官中的表达，未查询到FAM167A、CELF3、CACNA1E、PPP1R11、MGAT4A、PACS1、TGIF2、FUT9基因相关信息，22个靶基因在人体不同器官组织的特异性表达谱，见图1。单因素方差分析结果显示，不同器官和组织之间各靶基因的相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。

图1 22个靶基因在正常人体组织中的表达

2.5 hsa-miR-34a的靶基因GO富集分析结果

利用PANTHER在线工具对30个靶基因进行细胞组分和分子功能的GO富集分析，结果显示，靶基因SYT1和VAMP2集中表达在网格蛋白囊泡及囊泡膜（P<0.000 1），转运物质包括谷氨酸、单胺、γ-氨基丁酸；获得HCN3、SCN2B、SYT1、VAMP2基因GO分子功能注释信息，主要与电压门控钠通道活性及与syntaxin-1蛋白有关（P<0.05）；成功获得26个基因GO生物学过程注释信息（P<0.05），主要集中于多细胞生物过程和发育、神经系统发生和发育、解剖结构发育等。见表3、表4和图2。

图2 hsa-miR-34a预测靶基因的GO生物学过程分析结果

表3 hsa-miR-34a预测靶基因的GO细胞组分分析结果

表4 hsa-miR-34a预测靶基因的GO分子功能分析结果

2.6 hsa-miR-34a的靶基因通路富集分析

在GO富集分析的基础上，利用已有的生物通路数据，通过DAVID在线工具对靶基因集进行REACTOME生物通路富集分析。结果显示，hsa-miR-34a靶基因集中富集在B型和G型肉毒杆菌毒素毒性（富集倍数>300），同时还富集在人信号素4D（semaphorin 4D，Sema4D）介导的细胞黏附和迁移抑制，γ-氨基丁酸的合成、释放、再吸收和降解，乙酰胆碱等神经递质的释放循环等生物信号通路中。见表5。

表5 hsa-miR-34a预测靶基因的通路分析结果

2.7 hsa-miR-34a的靶蛋白相互作用网络分析

利用STRING数据库构建hsa-miR-34a的30个靶基因对应蛋白的互作网络，见图3。根据靶基因对应蛋白在该网络中的连接性，对靶基因重新进行排序，排在前5位的靶基因分别为SYT1、VAMP2、MET、RRAS、CACNA1E，这5个基因对应蛋白的关联值均>10。

图3 hsa-miR-34a的30个靶基因对应蛋白的互作网络

3 讨论

miRNA属于高度保守的非编码RNA分子，可特异性识别靶基因3'非翻译区（3' untranslated region，3' UTR）的相应靶位点，抑制特定靶基因的表达或降解靶基因。本研究结果显示，hsamiR-34a在乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中的表达显著降低。有研究结果显示，hsa-miR-34a可通过抑制700多个与细胞增殖、存活和可塑性有关的转录物来抑制肿瘤的发生、发展[21]，但具体作用机制尚不清楚。因此，对hsa-miR-34a进行多层面的生物信息学分析，对后续研究肿瘤的发生、发展及治疗有一定的指导意义。

目前已有一些研究提示了hsa-miR-34a抑癌的机制，在生理条件下，miR-34a在转录中沉默其原癌靶基因的表达，miR-34a的上调会导致细胞凋亡、细胞周期停滞、细胞衰老，进而可以抑制肿瘤细胞繁殖和迁移[4，22]，目前证实其涉及的靶基因、靶蛋白或信号通路有MET、CD44、Notch1、LEF1、E2F、PI3K/Akt等。miR-34a的低表达与其受到CpG甲基化修饰有关[23-24]，有研究证明，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）通过HPV E6/p53信号通路使miR-34a甲基化，抑制其表达，调节宫颈癌的Warburg效应，促进肿瘤的生长和侵袭[18]。

本研究选取进化程度不同的物种进行同源性分析，miR-34a对应基因序列在不同物种中的相似性较高，其中“UGGCAGUGU”序列为不同物种共同具有的保守区，人与倭黑猩猩、猕猴、婆罗洲猩猩等同源性较高的物种在基因上的位置也高度相似。本研究分析了22个靶基因在人体各器官和组织中的表达情况，发现大部分靶基因在人体各器官组织中均有表达，且在不同器官和组织中的表达量差异均无统计学意义（P>0.05），可见hsa-miR-34a的靶基因大部分具有广谱表达性；miR-34a对应基因的高度保守性和靶基因的广谱表达性提示miR-34对应基因可能有多个识别位点或多个靶标，发挥着重要的生物学功能。

本研究通过4个数据库（TargetScan、miRDB、miRWalk和mirDIP）预测hsa-miR-34a的靶基因，结果不尽相同，且基因数差距较大，取交集后基因数仍有225个。这一方面提示miR-34a生物学功能的广泛性和复杂性，另一方面也说明可能存在较高的假阳性率。因此，本研究采用Target Score功能对获得的基因进行排序，选取前30个靶基因进行分析，以增加预测的精确度，但在精确度增加的同时可能会对结果的全面性产生一定的影响。

在30个靶基因中，MDM4、Notch1、LEF1、Jagged1等基因已被证明在miR-34a抑制肿瘤中发挥重要的作用，进一步验证了miR-34a的抑癌作用。这些靶基因可作为分析miR-34a抑制肿瘤作用机制的重点方向。Target Score排序最高的基因为MDM4，是p53上游重要的调控因子。在生理条件下，miR-34a的转录主要由关键抑癌基因p53调控，通过与miR-34a区域附近多个典型的p53结合位点结合产生影响，但几个反馈回路，如p53/miR-34a/MDM4反馈环提示miR-34a参与了p53的调节[21，25-26]。

相对于对单个靶基因的研究和分析，多个靶基因的整合富集分析有助于更直接和全面地了解miR-34a的生物学功能。本研究通过GO富集分析发现hsa-miR-34a生物学功能广泛，其靶基因集中表达于网格蛋白囊泡和囊泡膜及其物质转运、细胞黏附和迁移、神经递质的合成和释放、多细胞生物过程等，这些都可能对肿瘤发生的各阶段产生影响，如miR-34a的靶基因富集于Sema4D介导的细胞黏附和迁移抑制，这很可能是miR-34a抑制肿瘤细胞黏附和迁移的重要机制，但目前尚缺乏直接的实验证据。值得注意的是，本研究通路分析及组织表达分布的结果均具有较强的指向性，提示miR-34a在神经系统的发育、形成及功能中具有重要的意义，而肿瘤的发生与神经因素也有着密不可分的关系[27]，由此推测miR-34a抑制肿瘤发生的机制可能与神经因素调节有关。

综上所述，本研究通过REACTOME通路分析和GO分析，初步探讨了miR-34a的靶基因及其生物学功能，可为后续的临床和基础研究提供参考依据。