BCHE基因复合杂合变异致丁酰胆碱酯酶缺乏症临床特征和遗传分析

王 娟， 余 静， 陈 珺， 郑 洪， 戴立英

（安徽省儿童医院新生儿科，安徽 合肥 230051）

丁酰胆碱酯酶（butyrylcholine eterase，BChE）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是人类胆碱酯酶的2种类型，AChE主要分布于神经组织，BChE主要由肝脏产生并分布于所有组织[1]。BChE的生理功能尚不明确，但对含酯药物，包括某些短效神经肌肉阻断剂、普鲁卡因、丁卡因及海洛因等分解代谢具有重要的药理学意义[2-3]。丁酰胆碱酯酶缺乏症（butyrylcholinesterase deficiency，BCHED）患者通常没有生命危险，但由于其对肌肉松弛剂等药物敏感性较高，可能会在应用类似药物后长期昏迷，甚至死亡[4]。BCHE基因变异导致的BCHED（OMIM#617936）可引起人体血清胆碱酯酶异常降低，多数情况下无临床表现，但近年来偶有报道BCHED患儿存在智力障碍[4-5]。本研究对2例由BCHE基因复合杂合变异导致的BCHED患儿进行报道，并分析其遗传学特征。

1 材料和方法

1.1 研究对象

患儿1，女，汉族，出生26 d，系其母第2胎第2产，孕周39+4周剖宫娩出，Apgar评分为9～10分，患儿于出生20 d起无明显诱因出现“腹胀伴腹泻”，就诊于当地医院，黄色水样便，频次7～8次/d，给予地衣芽孢杆菌活菌胶囊和醒脾养儿颗粒治疗后，大便呈绿色伴奶瓣，频次较前稍减，但仍未能控制，后因“新生儿腹泻、新生儿肺炎”转院至安徽省儿童医院新生儿科。

患儿2，女，汉族，出生23 d，系其母第1胎第1产，孕周38+2周顺产，Apgar评分为9～10分，患儿因皮肤黄染半月就诊于安徽省儿童医院新生儿科。

2例患儿父母及患儿1的哥哥（3岁）身体健康，否认近亲结婚及家族遗传史。

1.2 方法

1.2.1 基因测序 患儿父母均签署知情同意书，经安徽省儿童医院医学伦理委员会批准，对患儿及父母行全外显子家系检测（trio-based wholeexome sequencing，trio-WES）。采集核心家系成员外周血各3 mL，乙二胺四乙酸抗凝。根据基因组提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）说明书提取白细胞DNA，构建文库后用Illumina Miseq高通量测序仪（美国Illumina公司）对设计序列进行捕获，设计序列可覆盖基因全外显子区域及部分内含子区，参考序列为美国国家生物技术信息中心数据库人类基因组参考序列19版，利用GATK软件（美国Broad研究院）分析得出单核苷酸变异及插入、缺失等变异，过滤无效变异后，对可靠变异谱进行危害性预测分析。参考Ensembl数据库（http：//grch37.ensembl.org）设计可疑变异引物，采用Sanger测序进行验证，检测仪器为ABI 3130XL分析仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。

1.2.2 变异注释与蛋白结构模型预测分析 首先搜索公共数据库（SNP数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库），统计变异位点在正常人群中的发生频率。在ClinVar数据库（http：//www.ncbi.nlh.gov/clinvar/）和HGMD数据库（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）中检索变异位点的报道情况。采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、Polyphen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及Mutation Taster（https：//www.mutationtaster.org/）在线平台分析变异位点的生物危害性，最后根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南[6]进行基因致病性分析。另外，本研究通过Uniprot数据库下载多物种BCHE蛋白序列文件，采用Mega软件（新西兰Mega公司）对变异位点进行同源性保守分析，采用Deepview软件（瑞士生物信息研究院）对错义变异进行模型分析。

2 结果

2.1 患儿临床资料

患儿1入院体格检查：神志清、反应可，全身皮肤无黄染。患儿2入院体格检查：面部及全身黄染，神志清、反应一般，皮肤弹性可。实验室检查提示2例患儿均出现胆碱酯酶异常降低，总胆红素（total bilirubin，TB）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBil）升高。2例患儿丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）均正常，甲型肝炎病毒IgM抗体、丙型肝炎病毒抗体及乙型肝炎5项血清学指标均为阴性，粪便镜检未见真菌菌丝、真菌孢子、寄生虫卵，粪便轮状病毒及腺病毒检测均为阴性；入院前期未进行药物干预，且肝、胆、脾、胰超声检查未见明显占位性病变。因此，临床排除药源性胆碱酯酶降低。2例患儿各项指标检测结果见表1。

表1 2例患儿实验室检测数据

2.2 BCHE基因检测结果

2例患儿BCHE基因均发生复合杂合变异。患儿1为c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24和c.221delC/p.Pro74Hisfs*4，父亲携带杂合变异c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24，母亲携带杂合变异c.221delC/p.Pro74Hisfs*4。患儿2为c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24与c.127G>A/p.Gly43Arg，父亲携带杂合变异c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24，母亲携带杂合变异c.127G>A/p.Gly43Arg。Sanger测序证实存在变异位点。见图1。

图1 BCHE基因检测结果

2.3 变异位点分析

对照正常人群变异分布，患儿1携带的变异位点c.401_c.402insA在Genome AD数据库中次要等位基因频率为0.000 9，另一个变异位点c.221delC在SNP数据库、千人基因组数据库及ExAC数据库中均未被收录，ClinVar及HGMD数据库也未见相关报道，属BCHE基因新的变异。患儿2携带错义变异c.127G>A，该变异位点经SIFT、Polyphen-2及MutationTaster在线分析，结果分别为0.009（有害的）、1.0（可能有害的）及1（致病的），预测该变异位点对蛋白功能可能存在危害性。依据ACMG指南，变异位点c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24为“致病性（PVS1+PS3）”、变异位点c.221delC/p.Pro74Hisfs*4为“可能致病性（PVS1+PM2）”，变异位点c.127G>A/p.Gly43Arg为“不确定性（PM1+PM2+PP3）”。

蛋白同源分析结果显示，p.Gly43在不同物种间高度保守，且位于BCHE蛋白活性区域。当发生p.Gly43Arg变异时，可导致其在空间结构上与p.Thr54残基发生碰撞，影响局部结构稳定性，进而可能产生危害性。见图2。

图2 变异蛋白空间结构分析

3 讨论

BChE是一种具有复杂分子结构的代谢酶，可对部分肌肉松弛剂（如琥珀酰胆碱）或普鲁卡因等进行高效水解[2，7]。缺乏BChE的患者因对部分药物代谢速度减缓，敏感性增强，较少出现疾病表型[5]。导致人体血清BChE降低的主要因素为肝脏疾病、肾脏疾病、营养不良、烧伤、体温过低和怀孕，次要因素为包括毒品在内的化学品及部分药物，如单胺氧化酶抑制剂[8-10]。BCHED是由BCHE基因变异导致的，目前至少已报道了70种以上的BCHE基因变异，此类出现遗传变异的患者通常无临床表现，但若在术前使用琥珀酰胆碱等药物，则易导致神经肌肉阻滞延长，进而引起呼吸暂停或昏迷[11]。本研究中的2例患儿均出现血清胆碱酯酶异常降低，其中患儿1首发症状为不明原因新生儿腹泻，而患儿2表现为新生儿黄疸，经实验室检测确认无肝功能损伤，且无药物中毒可能。BCHED患儿出现腹泻表现的发病机制虽尚不明确，但已有的研究结果或能解释其关联性。与AChE在调节胆碱能信号方面的明确机制不同，BChE生理功能至今仍不清楚[10]。在正常生理环境下，BChE既可水解乙酰胆碱，也可水解丁酰胆碱，而乙酰胆碱水平降低可阻断神经传导；当BChE严重缺乏时，乙酰胆碱水平会异常升高，并激活胆碱能受体，使得肌肉收缩、胃肠道功能紊乱、尿失禁、副交感神经张力增大，进而导致腹泻发生的风险升高[2，12]。

BCHE基因位于3号染色体q26.1-q26.2区间，由4个外显子组成，其编码的BChE呈中心富集脯氨酸的四聚体结构，可分布于全身组织，尤其高表达于肝脏、肺、大脑及心脏等器官，其表达量高于AChE，因此肝脏等器官损伤会引起BChE水平降低[13-15]。本研究2例患儿BCHE基因发生复合杂合变异，且均携带c.401_c.402insA杂合变异。有研究报道，1例具有轻度智力障碍的14岁中国男孩存在该变异位点，由于BChE与AChE共同调控神经节、轴突、神经末梢及椎体生长等生理过程，因此当BChE水平严重缺乏时，可能会下调相关神经系统功能，进而出现智力障碍的临床表现[5]。BCHE基因变异导致BCHED的报道较少，因此需更多样本以确定c.401_c.402insA杂合变异是否为我国人群的热点变异。另外，患儿1携带的c.221delC杂合变异和患儿2携带的c.127G>A杂合变异在GlinVar等数据库中尚未查到相关数据，属BCHE基因新变异，这也进一步拓展了BCHE基因变异谱-表型谱。

BCHED发病率在不同人群中有较大差别。BChE水平在正常水平10%以下的类型称为沉默型BCHED，在欧美人群中极为罕见，BCHE基因纯合变异发生率约为1/100 000[2]；但在印度Vysya社区高频发生，有研究随机检测了该地区221名居民，有9例为BCHE基因纯合变异[15-16]。BCHED的另一种类型为K-型，BChE常低于正常水平的30%，该型在欧美人群及日本人群中最常见，约有1/70的患者BCHE蛋白第539号丙氨酸变异为苏氨酸（p.Ala539Thr），而在K-型纯合变异人群中至今尚未见肌肉松弛剂不良反应的报道[17]。我国尚无BCHED相关大规模队列研究，因此尚不清楚中国人群特异性变异类型及发病率。

综上所述，本研究分析了2例因BCHE基因复合杂合变异导致的BCHED患儿临床特征和遗传信息，发现2个BCHE基因新变异（c.221delC与c.127G>A）。c.221delC为功能丢失型变异，可能会导致蛋白功能降低；变异位点c.127G>A位于N-联糖基化区域，可能影响局部酶结合功能。BCHED通常无临床表型，但应用琥珀酰胆碱等肌肉松弛剂时会增加呼吸抑制及昏迷等风险，应避免对患儿使用这类药物。本研究患儿1出现新生儿腹泻症状是否与BCHE基因变异相关，仍需更多病例报道来进行综合分析，因此确定BCHE基因型与表型的关联性非常重要。