UroQuick尿液快速培养技术在儿童尿路感染诊断中的应用

潘 芬， 潘雨萱， 石迎迎， 于方圆， 张 泓

（上海市儿童医院 上海交通大学医学院附属儿童医院检验科，上海 200062）

尿路感染（urinary tract infection，UTI）是儿童常见的感染之一[1-2]。清洁中段尿细菌定量培养是诊断UTI的金标准。然而，传统尿液培养一般需要3～4 d才能到细菌鉴定及药物敏感性结果，且存在70%～80%的假阴性率，严重影响了临床的及时治疗[3-4]。有研究发现，UroQuick快速培养法可在较短时间内报告病原及其定量结果，有助于临床早期诊断[5-6]。本研究拟通过比较UroQuick快速培养法和尿液定量培养法检测结果，探讨UroQuick快速培养用于快速诊断、鉴别及排除儿童UTI的临床价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2019年12月—2020年1月上海市儿童医院门诊及住院的235例疑似UTI的0～14岁患儿清洁中段尿样本（剔除尿液污染或留取不规范的样本），患儿男性132例、女性103例。

1.2 仪器与试剂

UroQuick尿液快速培养仪及配套试剂（意大利ALIFAX公司），MALDI-TOF质谱仪（德国Bruker公司），哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯平板（上海伊华生物有限公司）。

1.3 尿液定量培养及细菌鉴定

严格按照第4版《全国临床检验操作规程》[7]要求进行清洁中段尿样本细菌培养。用10 μL定量接种环获取尿液，分别接种于血琼脂平板和麦康凯平板，置于37 ℃、5%CO2环境下孵育18～20 h。当平板菌落数≥10个时，挑取平板上单个菌落进行分离纯化，并采用MALDITOF质谱仪鉴定到种。

1.4 UroQuick尿液快速培养

严格按照试剂盒说明书要求进行操作，采用无菌操作取500 μL的中段尿液，加入2 mL液体培养基中，混匀后放入UroQuick尿液快速培养仪中孵育培养，通过激光散射技术实时监测生长动力学曲线，当培养瓶内有细菌生长（阈值为500 CFU/mL）时，仪器会给出样本的浊度值，并根据生长曲线采用非线性最小二乘拟合的算法计算出原始样本中的菌量浓度。

培养报阳后，采用一次性针头抽取1 mL液体培养基于1.5 mL Eppendorf管中，1 3 8 0 0×g离心5 m i n，弃上清，再加入300 μL 0.9%氯化钠溶液，混匀后继续离心5 min，去除多余的蛋白质，再13 800×g离心5 min，弃上清，取适量沉淀物涂抹于MALDITOF靶板上，采用甲酸提取法[8]和MALDI-TOF质谱仪快速鉴定细菌到种。同时，将离心沉淀物进行革兰染色涂片，分别接种于血琼脂平板和麦康凯平板，第2天观察菌落形态，并进一步鉴定以明确快速质谱鉴定结果是否准确；若3 h内呈阴性，则转种于血琼脂平板，于37 ℃5%CO2环境下孵育18～20 h，第2天观察细菌生长情况，以明确是否为阴性结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，比较采用χ2检验。非正态分布计量资料采用中位数（M）[四分位数（P2.5～P97.5）]表示。以尿液定量培养为金标准，分别按照浊度值和菌量浓度计算原则，采用McNemar χ2检验和Kappa检验分析UroQuick快速尿液培养法的差异性和一致性。采用MedCalc软件计算UroQuick快速培养诊断UTI的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中段尿定量培养结果

235例清洁中段尿样本中，有58例培养出病原菌，阳性率为24.7%，其中43例培养出细菌，4例培养出真菌，11例2种病原均检出。43株细菌中，革兰阴性杆菌27株（62.8%），以大肠埃希菌多见；革兰阳性球菌16株（37.2%），以屎肠球菌多见。见表1。

2.2 UroQuick尿液快速检测结果

235例清洁中段尿样本中，按照浊度值计算，UroQuick检测法为阳性的有69例，阳性率为29.4%，其中55例培养出细菌、3例培养出真菌，11例2种病原均检出。55株细菌中，革兰阴性杆菌35株（63.6%），以大肠埃希菌多见；革兰阳性球菌有20株（36.4%），以屎肠球菌多见；见表1。UroQuick检测法阳性检出率高于中段尿定量培养法，部分结果不一致的样本进一步结合尿常规检测综合分析，仍判断为感染菌。

2.3 2种方法检测结果比较

以常规中段尿定量培养作为金标准，将235例样本分为阴性组（177例）和阳性组（58例），分析UroQuick尿液快速培养法的浊度值和菌量浓度（图1），结果显示，阴性组浊度值中位数为0，阳性组浊度值中位数为1.39，2个组之间差异有统计学意义（P<0.001）；阴性组的菌量浓度为0 CFU/mL，阳性组菌量浓度为50万 CFU/mL，2个组之间差异有统计学意义（P<0.001）。进一步分析2种方法细菌检出结果的一致性，结果显示，2种方法一致率为86.8%（204/235），其中阴性一致率为91.0%（161/177），阳性一致率为74.1%（43/58）。将2种方法分别与MALDI-TOF质谱鉴定结果结合，用于细菌鉴定，发现除2种或2种以上病原鉴定率较低外，UroQuick检测法4～5 h即可得到病原鉴定结果，而尿液定量培养则需要18～24 h才能获得结果。

图1 UroQuick快速培养法在尿液定量培养阴性组和阳性组中的浊度、菌量浓度分布

2.4 UroQuick尿液快速检测方法诊断UTI的效能

以常规中段尿液定量培养为金标准，以UroQuick检测的浊度值作为计算原则，UroQuick快速培养法诊断UTI的敏感性为84.48%，特异性为88.70%，阳性预测值为71.01%，阴性预测值为94.58%；以UroQuick检测的菌量浓度作为计算原则，UroQuick快速培养法诊断UTI的敏感性为82.76%，特异性为92.66%，阳性预测值为78.69%，阴性预测值为94.25%。见表2。

表2 UroQuick快速培养法诊断UTI的效能

UroQuick尿液快速培养法浊度与菌量浓度的相关性分析结果显示，有8例样本仅有浊度值，而菌量浓度为0 CFU/mL；进一步将上述样本接种于相应平板，培养结果均为阳性。考虑其可能是中段尿样本菌量较少，未达到检测阈值或其他样本内在因素导致的。见表3。

表3 UroQuick快速培养法浊度与菌量浓度不符合样本

3 讨论

UTI是儿童常见的感染性疾病之一，由于儿童年龄较小、清洁中段尿样本取样较为困难等因素，使得儿童UTI的病原菌检出阳性率较低。目前针对儿童细菌UTI的诊断阈值存在年龄差异[9-10]，准确判断清洁中段尿液样本中病原的菌量对诊断儿童UTI具有较为重要的意义。然而，传统细菌培养操作步骤较为繁琐、检测周期较长，亟需一种快速培养技术用于UTI的快速诊断。

UroQuick尿液快速培养技术基于液体培养实时监测细菌生长，能在3 h内快速检出清洁中段尿样本中是否存在细菌，并明确相应的浓度[11]。UroQuick检测一般根据细菌生长动力学曲线给出浊度值和菌量浓度，本研究以常规中段尿定量培养法为金标准，发现尿液培养阴性组与阳性组浊度和菌量浓度差异均有统计学意义（P<0.05），且2种方法结果一致性较好，这与UroQucik仅检测活菌生长，红细胞、白细胞、上皮细胞等其他干扰因素由最初的空白值读数消除有关，也说明无论按照浊度值还是按照菌量浓度计算，均能有效区分该样本中是否存在活菌。进一步评估UroQuick快速培养法诊断UTI的效能，发现无论按照浊度还是按照菌量浓度计算，该方法的敏感性均>80%，且对高浓度菌量的样本敏感性高于低浓度样本，但略低于国外的研究报道[11-12]。本研究发现，UroQuick快速培养法按菌量浓度计算诊断UTI的特异性高于按浊度值计算（92.66%和88.70%），但阴性预测值均>90%，提示UroQuick快速培养法快速筛查UTI具有较大的价值，尤其对菌量浓度为0的样本，建议用浊度值作为样本是否存在病原的判断标准。本研究将UroQuick快速培养法与MALDI-TOF技术相结合用于细菌鉴定，发现UroQuick快速培养法检测单一病原菌生长的报阳尿液样本，可在3 h内得到阳性结果，离心取沉淀进行MALDI-TOF质谱鉴定，可在1 h内直接鉴定病原到种，2种方法联合用于单一生长的病原检测共耗时4～5 h，明显缩短了尿液培养的时间，当天即可给予临床医生病原检测报告，有助于临床医生及时根据病原种类调整用药，控制病情发展[13]。但该方法不适用于多种细菌生长的样本。

此外，本研究尿液定量培养检出的58例阳性结果中，有43例检出细菌、4例检出真菌、11例2种病原均检出；而UroQuick快速培养法检出的69例阳性结果中，有55例检出细菌、3例检出真菌，1例2种病原均检出；2种方法一致率为86.8%，且对大多数常见细菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌）检出情况较为一致。但仍有31例样本检测结果不一致，主要有2种情况：（1）针对部分菌量较低的尿液样本，由于UroQucik快速培养法检测阈值为500 CFU/mL，因此部分浓度较低且常规定量接种法为阴性的样本易被检出；（2）针对部分多种病原生长的样本，常规定量接种法采用10 μL的接种量，会导致菌量较少的病原被菌量较多的病原掩盖，常规方法无法区分，而UroQuick快速培养法加入500 μL进行孵育，使得部分多种病原生长的样本更容易被检出。建议采用UroQuick快速培养法检测细菌浓度较低的中段尿样本时结合尿常规或患者临床症状来确定其是否为感染病原菌。本研究中，UroQuick快速培养法未检出尿液样本中含有的铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、皮氏不动杆菌，3例样本分别培养为阴性、奇异变形杆菌和2种细菌生长，综合3例患儿的尿常规情况，考虑可能是在菌量浓度较低或操作过程中有污染。由于UroQuick快速培养法的原理是基于激光散射技术，根据细菌生长特性，分别从30°和90° 2个方向采集细菌颗粒的散射光，并采用非线性最小二乘拟合的算法计算出原样本中的细菌浓度，所以存在以下问题：（1）该方法尚无法区别感染菌与污染菌，对多种病原生长的尿液样本的诊断意义仍有待进一步探讨[13]；（2）UroOucik快速培养法仅给出尿液样本中细菌的浊度值和浓度值，无法检测尿液中的白细胞，建议在使用该方法时结合尿常规结果综合判断；（3）本研究设定的UroQuick快速培养法的最低检测限为500 CFU/mL，当尿液样本较浑浊，且菌量较少时，可能会影响病原的检出，建议对此类样本进行适当稀释，以减少蛋白或白细胞等因素的影响。

综上所述，UroQuick快速培养法可作为一种新的尿液快速培养技术，无论按照浊度结果还是菌量浓度结果计算均具有较好的特异性和阴性预测值，可用于儿童UTI的早期筛查。此外，UroQuick检测法3 h即可得到细菌浓度的检测结果，结合MALDI-TOF质谱鉴定技术可直接对报阳后的样本（单一细菌生长）进行细菌鉴定（种），缩短了清洁中段尿液样本的培养时间，为儿童UTI提供快速的病原学诊断依据，未来若能将快速培养技术与药物敏感性试验相结合，也能在一定程度上缩短药物敏感性试验报告时间，有助于儿童UTI的早期诊疗。