聚氨酯泡沫固定化生物体系对活性蓝4的吸附脱色

杨文博，张傲洁，刘幽燕，李青云

(广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004)

蒽醌染料是分子中含有蒽醌结构的各类染料的总称，现已有400多个品种，约占合成染料总量的20%[1-2]。由于其染色性能佳、易得性好、价格低廉而成为工业生产的首选染料，在合成染料中具有很重要的地位[3]。蒽醌染料具有3个融合苯环以及中心环上有2个羰基的复杂结构，使得该类染料不仅能够在环境中稳定存在，而且对人体以及其他生物体的毒性高于偶氮染料[4]。活性蓝4(RB4)是蒽醌类染料中的一种，研究表明，100 mg/L的RB4能显著降低小麦种子的发芽率(27%)，并且使得根和枝的生长分别减少48%和29%,对人体淋巴细胞和角朊细胞的脱氧核糖核酸(DNA)均有显著的损伤作用[5]，因此消减蒽醌染料污染对保护生态环境安全和人类身体健康非常必要。目前，国内外主要采用物理法和化学法去除蒽醌染料，但是这些方法存在成本高、易产生二次污染等弊端[6-7]。生物吸附法被认为是绿色、价廉的可选策略之一[8-9]，许多真菌物种，如平菇Pleurotusostreatus[10]、烟管菌Bjerkanderaadusta[11]、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum[12]等已被证实能有效脱色蒽醌染料。然而，生物体系在脱色染料的过程中普遍存在吸附剂流失的问题，因此，如何维持体系的生物量对生物法去除染料尤为关键。

基于微生物依附生长的特性，将菌株限定生长于载体材料上的固定化技术是有效解决细胞流失的可行方法。尽管现有文献报道的固定化载体有很多，如活性碳纤维[13]、海泡石[14]、丝瓜络[15]等，但是只有选用适宜菌株生长的载体材料，才有可能构建获得生物固载量高且稳定性好的生物体系。聚氨酯泡沫(PUF)是一种成本低、力学强度高以及生物相容性好的多孔材料[16-17]。许多研究表明，采用PUF材料对不同种类真菌进行固定化可有效提高生物体系的处理效率[18]。例如：Wang等[19]采用PUF材料固定热带念珠菌Candidatropicalis发酵生产木糖醇，使得木糖醇的产率和体积产量分别达到71.2%和2.10 g/(L·h)。Hama等[20]研究发现：游离的米曲霉菌Aspergillusoryzae因聚集成菌丝球，导致细胞内部的氧气和营养物质的可用性受到限制；当采用PUF材料对菌株进行固定化之后，由于菌丝不再聚集成球，促进了氧气和营养物质的传质，从而使得固定化细胞分泌的磷脂酶A1是游离细胞的 2倍，因此，大孔结构的聚氨酯泡沫是固定化丝状真菌的理想载体之一。

本文课题组在前期研究工作中已筛选获得1株能有效脱色蒽醌染料的黄曲霉菌AspergillusflavusA5p1[21]，并采用PUF材料进行固定化，结果发现菌株能完全固定生长在PUF材料上，说明PUF材料可作为黄曲霉菌AspergillusflavusA5p1固定生长的良好载体。基于此，本文以染料RB4为模型底物，进一步研究PUF-固定化生物体系的脱色特性，包括RB4吸附动力学研究、不同RB4质量浓度和盐度条件(主要以NaCl质量浓度计)对脱色的影响。通过对比黄曲霉菌AspergillusflavusA5p1固定化前后对蒽醌染料RB4的脱色效果以及固定化体系的重复利用批次脱色效果，初步评估PUF-固定化细胞生物体系的可靠性，以期为未来新型染料污染处理工艺的发展提供参考。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：活性蓝4(RB4，分析纯，上海源叶生物科技有限公司)；聚氨酯泡沫(PUF，凯达新材料有限公司)，密度为(21±1)kg/m3，硬度为55±5(邵氏硬度)，孔径为60 孔/(25.4 mm)，开孔率为96%；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，分析纯，海博生物技术有限公司)；无水乙醇(分析纯，西陇化工股份有限公司)；吐温80(分析纯，北京索莱宝科技有限公司)；氯化钠(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)；黄曲霉菌AspergillusflavusA5p1(CGMCC 4292)，由实验室自行筛选并保存在-80 ℃冰箱中。

仪器：ME204E型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司)；G1100T型立式压力蒸汽灭菌锅(美国ZEALWAY公司)；IQ7000型超纯水机(德国Merck Milli-Q公司)；ZHWY-2102型恒温振荡培养箱(上海智诚分析制造有限公司)；SW-CJ-1BV型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；902型超低温冰箱(美国Thermo Scientific有限公司)；TS-606-G/4-i型培养箱(上海跃进医疗器械厂)；Allegra 25R型台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN COULTER有限公司)；EPOCH2T Microplate Reader酶标仪(美国BioTek有限公司)；50i型正置显微镜(日本尼康株式会社)；ALPHA 2-4LSC型冷冻干燥机(德国Christ有限公司)。

1.2 聚氨酯泡沫的预处理

将聚氨酯泡沫用电热丝切割成1 cm3块状，然后用70%乙醇浸洗2次，每次30 min，以去除其他有机物杂质。再用去离子水浸洗2次，每次30 min。最后放置于烘箱，80 ℃烘至恒态质量。

1.3 生物吸附剂的制备

取出-80 ℃保藏的实验菌株AspergillusflavusA5p1，接种至灭菌后的PDA培养基(质量浓度为4.6 g/L) 中，于30 ℃条件下培养5～7 d，然后用无菌的0.5%吐温80溶液洗脱孢子，过滤收集孢子悬液，再次传代培养至第3代，放置于冰箱，4 ℃保藏备用。

称取(0.50±0.005 0)g预处理的PUF载体材料进行高压蒸汽灭菌20 min，取出将其加到灭菌后的基础培养基中[21]，随后接入一定量的孢子悬浮液，接种量为8.6×104孢子/mL，30 ℃、150 r/min摇床培养2 d。用镊子夹出固定化细胞，用去离子水清洗2次后放入高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌20 min，于-45 ℃ 冷冻干燥，待用。

除不放置载体PUF之外，游离细胞的培养条件与固定化细胞的培养条件相同。将培养2 d的游离细胞取出，8 000 r/min条件下离心5 min，去除上层清液，用去离子水清洗细胞2次后在相同条件下灭活，于-45 ℃冷冻干燥，待用。

1.4 染料的吸附动力学

将灭活的PUF-固定化细胞和游离细胞分别投加到100 mL、染料RB4质量浓度为50～700 mg/L的溶液中，在30 ℃、150 r/min的条件下进行吸附实验。同时，将0.5 g PUF放入锥形瓶中作为对照组，考察载体PUF对RB4的吸附。染料RB4的质量浓度采用分光光度计法测定并计算而得[22]，经过全波段波长扫描，染料RB4的最大吸收波长为599 nm。根据染料RB4的质量浓度标准曲线以及体系的体积可以计算出染料RB4的质量，再由式(1)计算得到载体PUF对染料RB4的实际吸附量：

(1)

式中：Q为PUF对RB4的实际吸附量，mg/g；m0和me分别为体系中RB4的初始质量和吸附平衡时的质量，mg；m1为载体的质量，g。

Langmuir方程、Freundlich方程是研究材料吸附特性常用的经验式方程。Langmuir方程基于吸附剂表面性质均一、材料为单层吸附的假设；Freundlich方程用于描述均匀表面能量系统的非理想吸附。将载体PUF对不同浓度RB4染料的吸附平衡质量浓度和吸附量等基础数据，采用Origin Pro.2019软件对Langmuir方程(见式(2))、Freundlich方程(见式(3)) 进行拟合，建立吸附量和染料吸附平衡时的质量浓度之间的数学关系。

(2)

(3)

式中：Qe为吸附平衡时载体PUF的吸附量，mg/g；Ce为染料吸附平衡时的质量浓度，mg/L；KL为Langmuir常数，L/mg；Qm为PUF的最大理论吸附量，mg/g；KF为Freundlich常数，L/g；n为吸附强度常数。

分别测定PUF-固定化细胞和游离细胞体系对质量浓度为200 mg/L的染料RB4的脱色进程曲线，按照式(4)计算脱色率。同时采用Weber等[23]提出的颗粒内扩散动力学模型进行拟合，颗粒内扩散方程如式(5)所示。

(4)

Qt=Kit1/2+Ci

(5)

式中：D为脱色率，%；A0和At分别为RB4的初始吸光度和脱色t时后的吸光度；Qt为t时的染料吸附量，mg/g；t为吸附时间，min；Ki为颗粒扩散速率常数，mg/(g·min1/2)；Ci是与反应边界层厚度相关的常数。通常，Ci值越大，边界层效应越大。

1.5 脱色率测试

分别考察PUF-固定化细胞体系、游离细胞体系对不同质量浓度(100、300、500、700、1 000、1 500、2 000 mg/L)RB4的脱色率以及在不同NaCl质量浓度(1、5、10、20、30、40、50 g/L)条件下脱色的情况。每个样品做3个平行试样，在设定的脱色时间点取样测定体系中染料RB4的吸光度，根据式(4)计算脱色率。游离细胞体系的样品需先在 8 000 r/min 下离心5 min，然后取上层清液测定吸光度，由式(4)计算得到游离细胞体系的脱色率。

1.6 生物吸附剂重复使用性能测试

以摇瓶实验模拟染料废水的批次脱色，将菌株AspergillusflavusA5p1接种至100 mL添加有染料RB4的培养基(染料RB4最终质量浓度为300 mg/L)中，使其固定化生长的同时即实现对染料的吸附。每批次设定时间取出样品采用分光度计测定染料RB4的吸光度，按照式(4)计算脱色率。脱色结束后取出PUF-固定化细胞再次投入到新鲜配制的RB4溶液中进行下一个批次脱色实验。批次反应以12 h为1个脱色周期，考察重复使用7个批次的脱色情况。

游离细胞体系的重复使用条件同固定化细胞体系，但是游离细胞在脱色结束后需先在8 000 r/min下离心5 min，然后取出细胞重新投加到下一个批次的脱色实验。

2 结果与讨论

2.1 生物吸附剂对RB4的吸附动力学

首先考察载体PUF对染料RB4的吸附情况。图1示出载体PUF对RB4的吸附等温线。可以看出，Langmuir方程和Freundlich方程都能较好地描述载体PUF吸附RB4的过程，Langmuir方程具有更高的拟合度，由此认为载体PUF材料对质量浓度为50～700 mg/L的染料RB4的吸附为单分子层吸附，PUF表面吸附位点的性质较为均一。

图1 载体PUF对RB4的吸附等温线Fig.1 Adsorption isotherm of RB4 by PUF

表1示出吸附等温模型的参数拟合结果。可以看出，载体PUF对RB4的最大理论吸附量Qm为3.96 mg/g，与实验测定的实际吸附量3.35 mg/g较为接近。由Freundlich方程吸附强度常数n大于1可知，载体PUF对染料RB4的吸附较易进行。现有研究表明，载体PUF对染料的吸附能力与材料的物理化学性质以及染料的特性有关。Silveira等[24]在酸性条件下采用PUF吸附染料直接红80和活性蓝21的最大吸附量分别为4.50、8.31 mg/g，分析认为，载体PUF在酸性介质下带正电荷，增强了其与阴离子染料之间的静电作用，使得吸附更易进行。

表1 染料RB4吸附等温模型的拟合参数Tab.1 Fitting parameters of adsorption isotherm model

分别考察PUF-固定化细胞和游离细胞对200 mg/L染料 RB4的脱色效率，结果如图2所示。可以看出：PUF-固定化细胞的平衡吸附率为90.5%，20 min内吸附率可达到77.8%；而游离细胞的吸附过程较缓慢，90 min的吸附率仅为62.8%。

图2 染料RB4的吸附进程曲线Fig.2 Adsorption time curve of RB4

采用颗粒内扩散模型对RB4的吸附过程进行拟合，结果如图3所示。吸附过程分为3个阶段：1)吸附质从主体溶液输送到吸附剂的外表面；2)吸附质扩散到吸附剂的内表面；3)吸附质扩散到孔的内表面。图3的直线不通过原点(Ci=0)，说明边界层的厚度参与了对吸附过程的控制，颗粒内扩散不是吸附过程的唯一限速步骤。

图3 染料RB4的颗粒内扩散模型Fig.3 Intraparticle diffusion model of RB4

表2示出染料RB4颗粒内扩散模型的拟合参数。在染料向吸附剂外表面扩散的第1阶段，PUF-固定化细胞和游离细胞的扩散速率常数Ki1分别为60.7和15.3 mg/(g·min1/2)，反应边界层厚度相关常数Ci1分别为-132.1和-30.7。Ci1值不为零而为负值，说明此阶段的吸附快速发生在吸附剂的表面，吸附速率主要受界面扩散的影响[25]。从图3可看出，PUF-固定化细胞可在10 min内快速吸附RB4，这是因为菌株AspergillusflavusA5p1围绕载体PUF固定生长后，菌丝呈现交织缠绕的形态，相比于游离细胞的菌丝球形态，其活性位点增加，从而加快了对RB4的吸附，且载体PUF对染料RB4也有吸附作用，因此，PUF-固定化细胞的宏观吸附速率明显快于游离细胞。第2阶段为染料逐渐向吸附剂内表面扩散阶段，PUF-固定化细胞和游离细胞的扩散速率常数Ki2分别为0.901、5.094 mg/(g·min1/2)。由于PUF-固定化细胞在第1阶段达到较高的吸附量，因此随着RB4浓度的降低和可用吸附位点的减少，PUF-固定化细胞的吸附速率显著变小，此时的吸附主要受到颗粒内扩散的限制。第3阶段为孔内扩散阶段，此时达到吸附平衡，PUF-固定化细胞和游离细胞的扩散速率常数Ki3分别为0.041、0.070 mg/(g·min1/2)，二者的扩散速率常数差别不显著,分析认为载体PUF为大孔结构，染料在载体孔内的扩散可能与其在游离细胞间的孔道扩散相似。Saeed等[26]采用仿丝瓜络海绵固定绿色木霉Trichodermaviride去除100 mg/L甲基蓝，固定化细胞的最大吸附率为84.3%，远高于游离细胞61.4%的吸附率。研究者认为，仿丝瓜络海绵能为细胞提供开放的生物结构，增加有效接触面积，使得固定化细胞的吸附量增加。本文研究也获得类似的结果，生物吸附剂AspergillusflavusA5p1经过PUF固定化之后对染料RB4的吸附率显著提高，载体PUF本身对染料RB4的吸附进一步增强了体系的脱色能力，使得该固定化体系的脱色率显著高于游离细胞体系。

表2 染料RB4颗粒内扩散模型的拟合参数Tab.2 Fitting parameters of intraparticle diffusion model for RB4 adsorption

2.2 生物体系对不同浓度RB4的脱色

染料对生命有机体的毒害作用是限制生物法脱色的关键因素之一，因此考察了生物体系对不同浓度RB4的吸附脱色效果，结果如图4所示。可以看出，染料质量浓度为100 mg/L时，PUF-固定化细胞对RB4的吸附量与游离细胞无明显差异，但随着RB4质量浓度的增加，PUF-固定化细胞的吸附量明显高于游离细胞。当RB4质量浓度为2 000 mg/L时，固定化细胞对RB4的吸附量约为游离细胞的2.5倍，表明PUF-固定化细胞体系可耐受高浓度的RB4染料。Gan等[27]采用桉叶固定洋葱伯克霍尔德菌Burkholderiacepacia脱色孔雀石绿(MG)发现，固定化载体表面的负电荷可促进染料从溶液转移到细胞活性位点区域，因此，固定化体系对MG的吸附增强。更多的研究认为载体对微生物具有保护作用，从而可有效减少不良环境对菌株的毒害。例如：1株斯氏普罗威登斯菌ProvidenciastuartiiPL4经过PUF固定化之后可在120 h内降解2 500 mg/L的苯酚，而游离细胞仅能降解质量浓度为150 mg/L的苯酚[28]，展示出PUF-固定化细胞体系在处理高浓度污染物方面的优势。本文研究中的PUF-固定化细胞体系对高浓度RB4也具有良好的吸附能力，菌体吸附与载体吸附的协同作用强化了PUF-固定化细胞体系对染料RB4的吸附脱色。

图4 生物体系对不同质量浓度RB4的脱色Fig.4 Decolorization of RB4 at different concentrations by biological systems

2.3 NaCl质量浓度对生物体系的脱色影响

典型的活性染料染色工艺常添加60～100 g/L的无机盐[29]，产生的染料废水所含无机盐的质量分数高达15%～25%，组分主要是NaCl，少量Na2SO4、KCl以及其他金属盐[30]。高盐条件(以NaCl 质量分数大于3.5%计)会严重抑制微生物的活性或者导致细胞质壁分离、活性完全丧失，对生物处理过程非常不利[31]，因此脱色染料废水的微生物需要有一定的耐盐性。图5示出生物体系在不同NaCl质量浓度条件下的脱色效果。

图5 生物体系在不同NaCl质量浓度条件下的脱色Fig.5 Decolorization of RB4 by biological systems at different concentrations of NaCl

从图5可以看出，NaCl质量浓度为1～10 g/L时对 PUF-固定化细胞体系的脱色影响不显著，游离细胞体系的脱色率则随NaCl质量浓度的增加而显著下降。当NaCl质量浓度为10、50 g/L时，PUF-固定化细胞仍然保持较高的活性，RB4的脱色率分别为94.5%、75.2%，而游离细胞的脱色率仅为66.1%、49.6%。NaCl质量浓度为10 g/L是游离细胞体系的分界点，此质量浓度下的脱色率减少程度最大，继续提高NaCl的质量浓度，脱色率的减小程度趋于平缓，说明细胞表面的活性官能团在10 g/L的NaCl质量浓度下可能被破坏而完全失活，体系脱色率的降低受细胞结构破坏和活性降低的共同影响。与游离细胞体系相比，PUF-固定化细胞体系对高盐条件表现出良好的耐受性，这可能与固定化载体的保护作用有关[28,32]。Yuan等[33]报道陶粒固定化厌氧微生物可以在5%的NaCl用量下使3种偶氮染料脱色，固定化细胞体系的平均脱色率比游离细胞体系高2.5倍。本文研究中的PUF-固定化细胞体系在NaCl质量浓度为50 g/L条件下的脱色率约是游离细胞体系的1.5倍，表明PUF-固定化AspergillusflavusA5p1在处理含盐染料废水方面具有巨大潜力。

2.4 生物体系重复批次脱色效果

重复利用性是固定化技术的显著优势之一，由于生物吸附剂经过固定化之后细胞不易流失，因此它可以反映生物体系的稳定性。图6示出PUF-固定化细胞体系和游离细胞体系对300 mg/L 染料RB4脱色的重复批次情况。以菌株AspergillusflavusA5p1的固定化生长和脱色作为第Ⅰ个批次，结果表明，菌株AspergillusflavusA5p1完成固定化生长和染料RB4的吸附脱色过程需要36 h，菌株固定化生长时间的长短与接种量、培养基组成等条件有关[34-35]。与PUF-固定化细胞体系相比，36 h时游离细胞体系的RB4剩余质量浓度为49.9 mg/L，脱色率只达到83.3%，这可能是因为培养基中添加染料RB4之后对细胞生长有抑制作用，使得菌株生长较缓慢而导致脱色不完全。通常而言，吸附剂吸附饱和之后需要进行解吸再生才能再次吸附，但是在第Ⅱ个批次实验中，PUF-固定化细胞和游离细胞体系仍然具有脱色能力，PUF-固定化细胞体系12 h时的RB4剩余质量浓度为1.42 mg/L，脱色率高达99.5%。初步研究发现，菌株AspergillusflavusA5p1能够降解RB4，生物降解作用使得吸附剂得以再生，从而有利于吸附脱色过程的持续进行。随着重复使用批次的增加，生物吸附剂的流失会导致脱色率降低。从图6可见，游离细胞体系重复使用至第Ⅶ批次时，RB4的剩余质量浓度为76.6 mg/L，脱色率下降至74.3%，而PUF-固定化细胞体系中的RB4剩余质量浓度为33.1 mg/L，脱色率仍然能达到89%，反映了固定化体系在生物处理稳定性方面的优势。Mulla等[36]采用PUF、藻酸钠、藻酸钠-聚乙烯醇、琼脂以及聚丙烯酰胺固定微球菌Micrococcussp.strain SMN-1降解15 mmol/L的2-硝基苯，PUF-固定化细胞可重复使用24个周期，其他固定化细胞分别重复使用15、20、12和18个周期。由此可见，PUF材料良好的力学强度和生物固载能力，为生物固定化体系的长效、稳定运行提供了有利条件。

图6 生物体系重复批次脱色结果Fig.6 Repeated batches decolorization of RB4 by biological systems

3 结 论

1)采用聚氨酯泡沫(PUF)载体材料成功构建了黄曲霉菌AspergillusflavusA5p1的固定化生物体系，该体系在20 min时对200 mg/L蒽醌染料RB4的吸附率达到77.8%；与之相比，游离细胞体系在90 min时的吸附率仅为62.8%。生物体系对RB4的吸附脱色过程可以用颗粒扩散模型来描述，PUF-固定化细胞体系主要受界面扩散限制，游离细胞体系同时受界面和颗粒内扩散限制，而载体PUF对RB4的吸附符合Langmuir方程。

2)PUF-固定化细胞体系在RB4质量浓度为100～2 000 mg/L、NaCl质量浓度为1～50 g/L的范围内均能获得较高的脱色率，其具有处理高浓度染料废水、含盐染料废水的潜力。

3)PUF-固定化细胞体系重复使用7个批次的脱色率仍然能达到89%，而游离细胞体系的脱色率下降为74.3%，说明PUF载体能有效固定生物吸附剂，从而获得稳定的脱色效果。

FZXB