熟地黄对6-羟基多巴胺诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激的影响

王家鹏 孙晓杰

(山东中医药高等专科学校 1中医系，山东 烟台 264199；2招生就业处)

帕金森病是一种神经退行性疾病，其病理特征为脑黑质致密区域多巴胺能神经元缺失，神经元缺失可诱导纹状体多巴胺异常减少，诱导基底神经节异常，进而诱发行动迟缓、平衡功能障碍、肢体僵硬等运动症状，氧化应激被认为是多巴胺能神经细胞功能紊乱的重要原因〔1〕。目前常见的帕金森病治疗药物有多巴胺受体激动药、抗胆碱药等，这些药物多数为对症治疗，只能部分改善运动缺陷，且不能阻止病情进展，研发有效药物改善帕金森病备受关注〔2〕。熟地黄是玄参科植物地黄块根经过炮制加工而成，具有抗衰老、抗氧化、改善记忆力、调节免疫等作用〔3〕。有研究〔4〕显示，熟地黄能够缓解帕金森病模型大鼠异动症状。现阶段尚不清楚熟地黄对6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的多巴胺能神经细胞的影响。本实验研究熟地黄对6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激的影响和机制。

1 材料与方法

1.1材料 细胞：多巴胺能神经细胞SH-SY5Y(货号：258028)购自宁波明舟生物科技有限公司。多巴胺能神经细胞SH-SY5Y培养在含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液内，细胞培养条件为37℃，饱和湿度，5% CO2培养箱。药物：熟地黄(北京索莱宝科技有限公司，编号：DYS8270，规格：1 g)。试剂与仪器：6-OHDA(Sigma公司，美国，货号：H4381-100MG)；p38MAPK激活剂Anisomycin(Sigma公司，美国，货号：A5862-0.5ML)；兔抗p-p38MAPK抗体(Cell Signaling Technology公司，美国，货号：4511)；活性氧(ROS)检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：HR8786)；兔抗剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗体(Abcam公司，美国，货号：ab2302)；兔抗p38MAPK抗体(北京百奥莱博科技有限公司，货号：YT820)；兔抗Ki-67抗体(Abgent公司，美国，货号：A-AJ1427c)；丙二醛(MDA)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0020)；DMEM培养基(Sigma公司，美国，货号：DF-042-B)；兔抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(Abcam公司，美国，货号：ab53154)；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，货号：S0101S)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，货号：11011-8611)；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，货号：C0017)；流式细胞仪(Becton，Dickinson and Company公司，美国，LSRFortessa X-20型)；酶标仪(北京普凯瑞生物科技有限公司，SpectraMax iD5型)。

1.2分组及给药方法 取处于对数生长期的多巴胺能神经细胞，根据不同的实验需求接种到细胞培养板内，24 h后，添加不同浓度的含药培养液，对照组细胞培养液不添加任何药物，6-OHDA组、熟地黄低剂量组、熟地黄中剂量组、熟地黄高剂量组、熟地黄高剂量+Anisomycin组细胞培养液中均添加100 μmol/L的6-OHDA〔5〕，同时熟地黄低、中、高剂量组细胞培养液中分别添加120、240、480 μmol/L的熟地黄，熟地黄高剂量+Anisomycin组细胞培养液中添加480 μmol/L的熟地黄和2 ng/ml的p38MAPK激活剂Anisomycin〔6〕。各组细胞培养24 h后进行相关检测。

1.3检测指标与方法 (1)CCK-8实验检测细胞增殖：多巴胺能神经细胞按照每个孔内4 000个细胞接种到96孔板内，细胞培养24 h后，分别在每个孔内添加10 μl CCK-8溶液，继续孵育10 min，用酶标仪测定波长为450 nm的吸光度(OD)值，以OD值表示细胞增殖活性。(2)Western印迹检测相关蛋白表达：多巴胺能神经细胞按照每个孔内接种5×104个细胞接种到24孔板内，24 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，添加含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)溶液，放在冰上裂解，30 min后，在4℃条件下高速离心，收集蛋白上清，经二喹啉甲酸(BCA)方法检测蛋白浓度后，与2倍结合缓冲液混合煮沸5 min。在每个十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样孔内添加40 μg蛋白样品，先以90 V的电压电泳30 min后，再以120 V的电压电泳1.5 h。以200 mA恒流转膜1.5 h。将NC膜放置5%牛血清白蛋白溶液中封闭2 h。NC膜放在一抗溶液(p-p38MAPK、酶切Caspase-3抗体以1∶800稀释，p38MAPK抗体以1∶1 500稀释，Ki-67、Bax抗体以1∶1 000稀释)中，4℃摇床过夜。NC膜放在1∶2 000稀释后的二抗溶液内，在室温中结合2 h。ECL发光。Image J分析比较灰度值，以GAPDH校正。(3)流式细胞术检测凋亡：多巴胺能神经细胞按照每个孔内接种5×104个细胞接种到24孔板内，24 h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，每个测定样品取1×106个细胞，悬浮于500 μl的结合缓冲液中，分别添加5 μl的膜连蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)溶液，转移至避光条件下结合20 min，用流式细胞仪检测凋亡变化。(4)ROS、MDA、SOD含量和培养液上清中LDH检测：多巴胺能神经细胞按照每个孔内接种5×104个细胞接种到24孔板内，24 h后，收集细胞和培养液上清，以ROS检测试剂盒(CellROX Green荧光探针法)、MDA检测试剂盒(可见分光光度法)、SOD检测试剂盒(黄嘌呤氧化法)分别测定细胞中ROS、MDA、SOD含量，ROS检测结果以对照组为参照，分析其余各组ROS含量变化百分比；以LDH检测试剂盒(比色法)测定培养液上清中LDH含量，步骤均按照试剂盒说明书进行。

1.4统计学方法 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1熟地黄对多巴胺能神经细胞增殖影响 与0 μmol/L(0.56±0.06)比较，120、240、480 μmol/L的熟地黄处理后多巴胺能神经细胞增殖活性(0.51±0.08、0.49±0.06、0.47±0.07)没有变化(P>0.05)；960、1 920 μmol/L熟地黄处理后多巴胺能神经细胞增殖活性(0.40±0.06、0.32±0.04)显著降低(P<0.05)。选择对多巴胺能神经细胞没有毒性的120、240、480 μmol/L的熟地黄进行后续实验。

2.2熟地黄可抑制6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞中p38MAPK信号激活 与对照组(0.15±0.03)比较，6-OHDA组多巴胺能神经细胞中p-p38MAPK/p38MAPK表达量(0.89±0.09)显著升高(P<0.05)；与6-OHDA组比较，熟地黄低、中、高剂量组表达量(0.63±0.05、0.41±0.03、0.29±0.02)逐渐显著降低(P<0.05)；与熟地黄高剂量组比较，熟地黄高剂量+Anisomycin组表达量(0.45±0.06)显著升高(P<0.05)。见图1。

1～6：对照组、6-OHDA组、熟地黄低剂量组、熟地黄中剂量组、熟地黄高剂量组、熟地黄高剂量+Anisomycin组；同下图图1 各组多巴胺能神经细胞中p38MAPK信号 相关蛋白表达

2.3熟地黄调控p38MAPK对6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞增殖、凋亡影响 与对照组比较，6-OHDA组多巴胺能神经细胞增殖活性显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05)；与6-OHDA组比较，熟地黄低、中、高剂量组多巴胺能神经细胞增殖活性逐渐显著升高，凋亡率逐渐显著降低(P<0.05)；与熟地黄高剂量组比较，熟地黄高剂量+Anisomycin组多巴胺能神经细胞增殖活性显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05)。见图2，表1。

图2 各组多巴胺能神经细胞凋亡情况

表1 各组多巴胺能神经细胞增殖活性和凋亡率及Ki-67、Bax、酶切Caspase-3蛋白表达量比较

2.4熟地黄调控p38MAPK对6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞增殖、凋亡相关蛋白表达影响 与对照组比较，6-OHDA组多巴胺能神经细胞中Ki-67蛋白表达量显著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与6-OHDA组比较，熟地黄低、中、高剂量组多巴胺能神经细胞中Ki-67蛋白表达量逐渐显著升高，Bax、酶切Caspase-3蛋白表达量逐渐显著降低(P<0.05)；与熟地黄高剂量组比较，熟地黄高剂量+Anisomycin组多巴胺能神经细胞中Ki-67蛋白表达量显著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见表1，图3。

2.5熟地黄调控p38MAPK对6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激影响 与对照组比较，6-OHDA组多巴胺能神经细胞中SOD含量显著降低，ROS、MDA含量显著升高，培养液上清中LDH含量升高(P<0.05)；与6-OHDA组比较，熟地黄低、中、高剂量组多巴胺能神经细胞中SOD含量逐渐显著升高，ROS、MDA含量逐渐显著降低，培养液上清中LDH含量逐渐显著降低(P<0.05)；与熟地黄高剂量组比较，熟地黄高剂量+Anisomycin组多巴胺能神经细胞中SOD含量显著降低，ROS、MDA含量显著升高，培养液上清中LDH含量显著升高(P<0.05)。见表2。

图3 各组各组多巴胺能神经细胞中增殖和凋亡 相关蛋白表达

表2 各组多巴胺能神经细胞中ROS、MDA、SOD含量和培养液上清中LDH含量比较

3 讨 论

帕金森病属于神经退行性疾病，多发生于中老年人，也是中老年残疾的重要诱因〔7〕。帕金森病常见病理变化为脑黑质致密带多巴胺神经细胞脱落、缺失，目前尚不清楚帕金森病发生的原因，遗传因素、兴奋性因素、自身免疫因素、氧化应激、环境因素等均与其有关，其中氧化应激因素研究最多〔8,9〕。6-OHDA是常见的体外构建帕金森病细胞模型的诱导因子〔10〕。帕金森病条件下，多巴胺能神经细胞中合成大量ROS，这些ROS不能被抗氧化酶SOD等及时清除，诱导ROS聚集，而过量的ROS可促进脂质发生过氧化，生成MDA；脂质是细胞膜的重要组成部分，其过氧化后可诱导细胞膜完整性破坏，导致原本多存在于细胞内的LDH释放至细胞外，因此检测MDA、LDH水平可间接反映氧化应激水平〔11,12〕。过量的ROS还可以激活细胞凋亡蛋白如Bax、酶切Caspase-3，促进细胞凋亡发生〔13〕。Ki-67是细胞增殖标志蛋白，其表达变化与细胞增殖水平有关〔14〕。本实验结果表明，6-OHDA诱导多巴胺神经细胞氧化应激，激活细胞凋亡，成功构建了体外帕金森病细胞模型。

熟地黄是常见中药材，具有滋阴补肾的功效，现代药理学证明熟地黄有调节免疫力、改善骨质疏松、降血糖、抗衰老、抗氧化、改善肾功能等作用〔15〕。熟地黄对神经系统有保护作用，可以抑制阿尔茨海默病大鼠海马神经细胞损伤，减少Caspase-3活化〔16〕；熟地黄治疗后的注意缺陷多动障碍大鼠神经元发育明显改善〔17〕。熟地黄对帕金森病可能有治疗功效，复方地黄处理后的帕金森病动物模型运动障碍症状减轻〔18〕；熟地黄处理后的MPP+诱导的神经细胞凋亡减少，Bax和酶切Caspase-3蛋白表达减少〔19〕。本实验结果说明熟地黄能够减轻6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激，进而减少细胞凋亡，与以前的研究报道结果一致〔12〕，均提示熟地黄可能是帕金森病治疗的有效药物。

熟地黄作用机制与信号途径的转导有关〔20〕。本实验发现，熟地黄处理可降低多巴胺能神经细胞中p38MAPK磷酸化水平，熟地黄作用机制可能与p38MAPK有关。p38MAPK是MAPK信号通路的重要分支，在细胞增殖、氧化应激、细胞凋亡、细胞衰老、炎症、能量代谢过程中发挥作用〔21〕。有研究〔22〕表明，p38MAPK在帕金森病进展中过度激活，p38MAPK具有促进帕金森病发生的作用。p38MAPK在6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞中过度磷酸化，且抑制p38MAPK可改善多巴胺能神经细胞损伤〔23〕。本文以p38MAPK激活剂进一步验证熟地黄的作用机制，结果发现，p38MAPK激活剂能够逆转熟地黄对6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞增殖、凋亡和氧化应激的作用，提示熟地黄通过抑制p38MAPK信号发挥作用。

综上，熟地黄可能是帕金森病治疗的潜在药物，其能够通过抑制p38MAPK信号改善6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激，进而减少细胞凋亡。关于熟地黄通过何种具体靶向机制影响p38MAPK信号进而发挥作用还有待进一步研究。