下调miR-34a对PC12细胞阿尔茨海默病体外模型细胞凋亡和氧化损伤的影响

张丽 覃雪 何高见 罗爱华 高霞

(1达州市中心医院老年病科，四川 达州 635000；2达州职业技术学院临床医学院；3达州市中心医院心身医学科)

阿尔茨海默病是一种慢性中枢神经系统疾病，其发病较为隐匿，主要表现为获得性知识障碍、记忆力减退，常常伴随有工作、生活等正常行为障碍〔1〕。阿尔茨海默病是仅次于心脑血管疾病、脑卒中、癌症之后的影响老年人生活质量的常见疾病，阿尔茨海默病已经成为世界范围内的热点问题〔2〕。阿尔茨海默病的病理学特征为神经元丢失、大脑皮质萎缩及β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑等，目前阿尔茨海默病的发病机制还没有完全阐明，其中Aβ神经毒性研究较为透彻〔3〕。Aβ沉积产生的老年斑是阿尔茨海默病发生的重要原因。Aβ25～35是阿尔茨海默病发生的关键毒性物质，其可以诱导神经细胞氧化损伤，促进细胞凋亡发生〔4〕。研究显示，阿尔茨海默病还与miRNA的异常表达有关，miRNA参与影响神经细胞损伤过程〔5〕。miR-34a是一个在人体内广泛表达的小分子RNA，参与细胞生长、凋亡等过程〔6〕。以前的研究发现，miR-34a在阿尔茨海默病中表达上调，并且抑制miR-34a可以提高caspase-3活化水平，miR-34a在阿尔茨海默病中可能发挥促进作用〔7，8〕。本研究以PC12细胞为研究对象，用Aβ25～35处理构建PC12细胞阿尔茨海默病体外模型，探讨miR-34a在阿尔茨海默病神经细胞氧化损伤和细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 PC12细胞购自通派(上海)生物科技有限公司；p-蛋白激酶B(AKT)抗体购自美国Santacruze；Aβ25～35购自美国Sigma；inhibitor control、miR-34a inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司合成；活性氧(ROS)水平检测试剂盒购自上海前尘生物科技有限公司；AKT抗体购自美国Proteintech；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen；超氧化物歧化酶(SOD)水平检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；引物由广州伯信生物科技有限公司合成；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平检测试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3抗体购自美国Cell Signaling Technology。

1.2细胞分组及转染 PC12细胞分为空白对照组(Control)组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞分别在实验开始时用含有Aβ25～35浓度为20 μmol/L的细胞培养液培养，Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞分别为转染inhibitor control、miR-34a inhibitor的PC12细胞，细胞转染步骤完全按照Lipofectamine 2000转染试剂操作说明进行。

1.3实荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测miR-34a表达 Control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞培养24 h以后，收集细胞，在细胞中添加Trizol试剂，提取细胞中的总RNA，配制去除基因组DNA反应体系，包括：2 μl的5×gDNA Eraser缓冲液、200 μg总RNA、1 μl的gDNA Eraser，添加RNase free H2O至10 μl。在上述体系中添加1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I、3 μl的miRNA RT Primer、4 μl的5×PrimeScript缓冲液，添加RNase free H2O至20 μl，放在37℃孵育15 min，放在85℃孵育5 s，合成cDNA。配制PCR体系，包括：1 μl的cDNA模板、10 μl的SYBR Primer Ex Taq、0.4 μl的上游和下游引物，添加ddH2O至20 μl，PCR程序设置为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃退火20 s，40个循环。根据反应得到的Ct值，按照2-△△Ct法计算miR-34a表达水平，内参为U6。引物序列为：U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-34a上游：5′-GGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTA-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.4四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖 PC12细胞按照Control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组分组方法接种到96孔板内，放在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。取出培养板，在每个孔中添加10 μl的MTT溶液，放在37℃孵育4 h。然后将孔内的上清溶液弃掉，添加150 μl的二甲基亚砜溶液，震荡反应10 min。酶标仪上测定每个孔450 nm OD值，以OD值代表细胞增殖能力。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 Control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞培养24 h以后，收集细胞，用冰预冷以后的磷酸盐缓冲液(PBS)反复悬浮洗涤2次以后，在细胞中添加200 μl的Binding缓冲液充分混合，再吸取5 μl碘化丙啶(PI)及膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)溶液添加到细胞中，放在室温条件下结合孵育15 min，用流式细胞仪检测之前再添加300 μl的Binding缓冲液。

1.6Western印迹检测细胞中C-caspase-3、p-AKT、AKT蛋白表达 Control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞培养24 h以后，收集细胞，添加RIPA蛋白裂解试剂，放在冰上裂解20 min，4℃，12 000 r/min离心10 min。收集上清溶液，用二喹啉甲酸(BCA)法测定提取蛋白浓度，放在-80℃保存备用。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。在蛋白上样孔内添加30 μg的蛋白样品，蛋白样品在上样之前需要与等体积的电泳缓冲液混合煮沸5 min。设置电泳电压为100 V，电泳30 min以后，将电压设置为120 V，继续电泳2.5 h。取出凝胶，置于转膜缓冲液中浸泡5 min。将聚偏氟乙烯(PDVF)膜也浸泡在转膜缓冲液中。以400 mA的电流转膜50 min。取出NC膜，放在含有5%牛血清白蛋白的封闭液中孵育结合2 h，然后将NC膜放在含有1∶200稀释的C-caspase-3抗体、1∶600稀释的p-AKT抗体、1∶800稀释的AKT抗体中，放在4℃条件下孵育过夜。将PDVF膜置于1∶2 000稀释的二抗溶液中，在室温中孵育2 h。电化学发光(ECL)方法发光，分析条带的灰度值。内参为GAPDH，分析目的条带的表达变化。

1.7ROS、SOD、GSH-Px水平检测 Control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+Anti-NC组、Aβ25～35+Anti-miR-34a组细胞培养24 h以后，收集细胞，分别用ROS、SOD、GSH-Px水平检测试剂盒检测ROS、SOD、GSH-Px水平，步骤完全按照试剂盒说明进行。ROS水平检测结果以Control组作为内参，分析相对荧光强度。

1.8AKT信号抑制剂对下调miR-34a的PC12细胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px水平影响 取转染miR-34a inhibitor后的PC12细胞，用含有Aβ25～35浓度为20 μmol/L和LY294002浓度为50 μmol/L的细胞培养液培养，计为Aβ25～35+Anti-miR-34a+LY294002组，以Aβ25～35+Anti-miR-34a组作为对照，细胞培养24 h后，MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western印迹检测细胞中C-caspase-3、p-AKT、AKT蛋白表达，试剂盒检测ROS、SOD、GSH-Px水平，步骤同上。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞中miR-34a表达的影响 与Control组(1.00±0.08)比较，Aβ25～35处理以后的PC12细胞中的miR-34a表达水平(1.90±0.12)明显升高(P<0.05)；转染miR-34a inhibitor后的PC12细胞经过Aβ25～35处理以后，细胞中的miR-34a表达水平(0.75±0.06)较Aβ25～35+Anti-NC组(1.89±0.16)明显下降(P<0.05)。提示miR-34a inhibitor下调Aβ25～35条件下PC12细胞中miR-34a表达水平。

2.2miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞增殖和凋亡影响 Aβ25～35处理以后的PC12细胞增殖能力明显下降，细胞凋亡率明显升高，细胞中C-caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；转染miR-34a inhibitor后的PC12细胞经过Aβ25～35处理以后，细胞增殖能力明显升高，细胞凋亡率明显降低，细胞中C-caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图1、图2、表1。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35条件下PC12细胞增殖能力并减少细胞凋亡。

图1 流式细胞术检测细胞凋亡

1～4：Control组，Aβ25～35组，Aβ25～35+Anti-NC组，Aβ25～35+Anti-miR-34a组；图3同图2 Western印迹检测C-caspase-3蛋白表达

表1 各组PC12细胞OD值、凋亡率和 C-caspase-3蛋白水平比较

2.3miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞中ROS、SOD、GSH-Px水平影响 Aβ25～35处理以后的PC12细胞中ROS水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显下降(P<0.05)；转染miR-34a inhibitor后的PC12细胞经过Aβ25～35处理以后，细胞中ROS水平明显降低，SOD、GSH-Px水平明显升高(P<0.05)。见表2。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35条件下PC12细胞中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性，减少细胞中ROS积累。

表2 各组PC12细胞中ROS、SOD、 GSH-Px水平比较

2.4miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞中AKT信号影响 Aβ25～35处理以后的PC12细胞p-AKT蛋白水平明显下降(P<0.05)；转染miR-34a inhibitor后的PC12细胞经过Aβ25～35处理以后，细胞中p-AKT蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图3、表3。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35条件下PC12细胞中AKT信号激活水平。

图3 Western印迹检测各组PC12细胞 p-AKT、AKT蛋白水平

表3 各组PC12细胞中p-AKT、 AKT蛋白水平比较

2.5AKT信号抑制剂对miR-34a inhibitor激活Aβ25～35条件下PC12细胞中AKT信号的影响 AKT信号抑制剂处理后的转染miR-34a inhibitor的Aβ25～35条件下PC12细胞中p-AKT蛋白水平明显下降(P<0.05)。见图4、表4。提示AKT信号抑制剂减弱miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞中AKT信号激活作用。

2.6AKT信号抑制剂对miR-34a inhibitor影响Aβ25～35条件下PC12细胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px水平的作用 AKT信号抑制剂处理后的转染miR-34a inhibitor的Aβ25～35条件下PC12细胞OD值明显降低，细胞凋亡率明显升高，细胞中C-caspase-3蛋白水平明显升高，细胞中ROS水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显下降(P<0.05)。见图5、表5、图6。提示AKT信号抑制剂逆转miR-34a inhibitor对Aβ25～35条件下PC12细胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px影响。

1～2:Aβ25～35+Anti-miR-34a组,Aβ25～35+Anti-miR-34a+LY294002组；图6同图4 Western印迹检测两组PC12细胞 p-AKT、AKT蛋白水平

表4 两组PC12细胞中p-AKT、 AKT蛋白水平比较

图5 流式细胞术检测两组细胞凋亡

表5 两组PC12细胞OD值、凋亡率、C-caspase-3蛋白水平和ROS、SOD、GSH-Px水平比较

图6 Western印迹检测两组C-caspase-3蛋白表达

3 讨 论

Aβ是常用的体外研究阿尔茨海默病细胞模型诱导因子〔9〕。氧化损伤可以诱导细胞凋亡发生。研究显示，机体内的SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性下降以后，细胞内的ROS不能被及时清除而聚集在细胞内，过量的ROS能够激活细胞内的caspase凋亡反应，诱导细胞凋亡发生〔10〕。caspase-3是caspase凋亡反应的下游因子，也是细胞凋亡的执行因子，其活化后形成C-caspase-3能够不可逆的诱导细胞凋亡发生〔11〕。本研究结果提示Aβ25～35诱导PC12细胞凋亡和氧化损伤，说明构建了PC12细胞阿尔茨海默病体外模型。

miRNA是一种非编码的RNA，其长度一般在20 nt左右，在自然界真核生物体内广泛存在〔12〕。miRNA功能多样，其参与不同类型细胞生长、凋亡、能量代谢、氧化应激等生理过程，miRNA是一个重要调控因子〔13〕。有研究报道显示，miRNA还与多种人类疾病的发生有关，miRNA可能是疾病治疗的分子标志物〔14〕。最近的研究显示，miRNA参与阿尔茨海默病的发生，其与神经损伤有关〔15〕。以前的研究发现，miR-34a在阿尔茨海默病中表达上调，并且下调miR-34a可降低caspase-3活化水平〔6,7〕。本研究结果说明下调miR-34a可以改善PC12细胞阿尔茨海默病体外模型损伤，这与上述研究结果相符合，均证实下调miR-34a可能具有改善阿尔茨海默病的作用。

AKT信号通路在人体内的多个生理以及病理过程中均发挥重要作用，其可以影响细胞的生长、代谢、凋亡、衰老等过程，AKT磷酸化水平升高后标志着AKT信号通路被激活〔16～19〕。研究显示，AKT在阿尔茨海默病中激活水平下降，并且抑制AKT信号通路促进Aβ25～35条件下PC12细胞凋亡和损伤〔20～22〕。本实验显示，AKT信号通路抑制剂可以逆转下调miR-34a对Aβ25～35条件下PC12细胞增殖、凋亡和氧化损伤的作用，提示下调miR-34a通过激活AKT信号改善PC12细胞阿尔茨海默病体外模型损伤。

综上，miR-34a在阿尔茨海默病中可能发挥促进作用，下调其表达可以减少PC12细胞阿尔茨海默病体外模型细胞凋亡，改善氧化损伤，作用机制与激活AKT信号有关。以后实验中应探讨miR-34a通过何种靶向调控机制影响AKT信号通路及细胞凋亡和氧化损伤。