解整合素-金属蛋白酶9在非酒精性脂肪肝小鼠中表达

张勇勇 李三强 程维刚 李记天

(1河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)分子与生物学实验室，河南 郑州 450000；2河南科技大学基础医学院肝脏损伤与修复分子医学重点实验室；3河南省肝病防治工程技术研究中心；4河南科技大学第一附属医院)

随着生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝(NAFLD)患病率逐年上升，严重影响人们的身心健康〔1〕。NAFLD可以逐渐进展为肝纤维化、肝硬化及肝癌，是全球公认的第一大慢性肝病，但其发生发展的分子机制尚不完全清楚〔2〕。解整合素-金属蛋白酶(ADAM)9是近年来研究最热的ADAMs家族成员之一，在肝癌的发生、发展和转移过程中发挥重要作用〔3〕。ADAM9在酒精性肝损伤过程中有促进肝损伤的作用，但其在NAFLD中的作用尚不清楚。本研究采用高脂饲料喂养诱导小鼠NAFLD研究ADAM9的表达变化，探讨ADAM9在NAFLD中的作用。

1 材料方法

1.1动物与材料 健康SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体重(20±2)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。试剂：谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(浙江伊利康生物科技有限公司)；抗ADAM9单克隆抗体(美国圣克鲁斯生物技术公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；高脂饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)；二氨基联苯胺(DAB，上海百赛生物科技有限公司)。仪器：日立7180全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2模型制备〔4〕选用雄性C57BL/6小鼠40只，适应性饲养2 w后，随机分为正常组(10只)和模型组(30只)。模型组小鼠饲喂含60%脂肪的饲料，共12 w，诱导小鼠NAFLD，正常组给予常规饲料喂养。模型组分别于饲养4、8和12 w末各取10只小鼠分别为高脂饲养4 w、8 w、12 w组，各组按相应时间进行眼球取血制备血清，然后颈椎脱臼处死并分离肝组织。

1.3血清AST活性检测〔5〕用全自动生化分析仪检测血清中AST的活性。

1.4苏木素-伊红(HE)染色检测肝组织病理变化〔6〕分离小鼠肝组织固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，切片机4 μm厚度连续切片，常规HE染色。肝细胞坏死积分统计方法：显微镜下观察组织坏死情况，0分为未见坏死；1分为<2处坏死；2分为2～3处坏死；3分>3处坏死；4分为大片坏死区域。每组随机挑选10张HE染色图片，计算坏死积分，进行统计分析。

1.5免疫组化检测肝组织ADAM9蛋白表达水平〔7〕小鼠肝组织常规石蜡切片，按照免疫组化试剂盒说明书步骤进行操作，ADAM9抗体(1∶300稀释)4℃过夜，二抗孵育，DAB显色。利用Image Pro Plus6.0软件对每只小鼠肝脏切片至少12 mm2的区域进行组织测量，并进行半定量分析。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组血清AST活性表达变化 与正常组〔(105±13)U/L〕相比，高脂饲养4 w组AST活性〔(206±21)U/L〕明显升高(P<0.05)，高脂饲养8、12 w组AST活性〔(317±29)、(446±31)U/L〕进一步升高(P<0.01)。说明高脂饲养诱导小鼠肝损伤且损伤程度呈时间依赖性。

2.2各组肝组织HE染色 高脂饲养4 w组肝组织开始出现坏死，坏死积分〔(1.25±0.05)分〕显著高于正常组〔(0.02±0.01)分；P<0.05〕；高脂饲养8、12 w组肝组织中出现大片坏死，坏死积分〔(2.50±0.26)、(13.60±0.37)分〕进一步升高，且呈时间依赖性(P<0.01)。见图1。

图1 各组不同时间点肝脏HE染色(×200)

2.3各组肝组织ADAM9表达 与正常组(1.2±0.07)比较，高脂饲养4 w组肝组织中ADAM9阳性细胞表达量(12.3±1.23)显著升高(P<0.05)，高脂饲养8 w组肝组织中ADAM9阳性细胞表达量(43.6±3.56)达到顶峰且显著高于高脂饲养4 w组(P<0.01)，高脂饲养12 w组表达量(27.2±4.21)较高脂饲养8 w组明显降低(P<0.05)。见图2。

图2 免疫组织化检测各组不同时间点肝组织 ADAM9表达(×200)

3 讨 论

ADAM9是ADAMs家族的重要成员，具有细胞黏附和蛋白水解的功能，能够调控细胞膜表面的生长因子和受体的活性，有利于肿瘤转移〔8,9〕。各种不同病因的慢性肝疾病研究发现，活化肝星形细胞中ADAM9mRNA表达水平显著高于静止期肝星形细胞，推测ADAM9在多种肝纤维化疾病细胞外基质重塑过程中发挥重要作用〔10〕。孙海宽等〔11〕通过采用CRISPR/Cas9技术研究肝组织ADAM9基因表达变化时发现，ADAM9可抑制急性酒精性肝损伤小鼠中肝细胞的增殖。有研究同样发现〔12〕，在小鼠急性酒精性肝损伤过程中，ADAM9的表达呈现先升高后降低的趋势，提示其在肝损伤和修复过程中发挥重要作用。

本研究结果表明，高脂饲料喂养小鼠可以成功诱导肝损伤，ADAM9表达量在此过程中变化显著。AST主要分布于肝细胞的线粒体内，在肝细胞受损严重累及线粒体时被释放入血中，是反映肝细胞损伤的良好因子；HE染色可以直接观察肝组织损伤坏死情况，二者结合准确地反映了该研究造模成功。ADAM9表达量与正常组相比开始升高，达到顶峰后出现下降，这可能与肝损伤后出现的修复现象有关。

综上，ADAM9与NAFLD的发生发展密切相关，可能在此过程中起到了促进肝损伤的作用。