敛肝熄风止颤方对帕金森病大鼠内质网应激相关蛋白的影响

文晓东 谭文澜 梁明坤 刘钰 王春玲

(1广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2广西中医药大学)

帕金森病(PD)是常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，以黑质多巴胺能神经元大量变性丢失和神经胶质细胞内路易小体形成为特征性病理改变。研究表明，内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡及其通路相关基因的异常表达在PD的发病过程中发挥重要作用〔1〕。当细胞遭遇外界刺激时，葡萄糖调节蛋白(GRP)78/钙蛋白酶(calpain)/半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12信号通路是ERS介导的相关凋亡通路之一〔2，3〕。敛肝熄风止颤方源自《伤寒论·厥阴病》主方乌梅丸，是临床治疗PD的经验方。研究表明，敛肝熄风止颤方可抑制黑质神经细胞的凋亡〔4〕，提示敛肝熄风止颤方对PD具有保护作用。鉴于ERS对PD的调控作用，本研究从调节ERS减少多巴胺能神经元凋亡角度探讨敛肝熄风止颤方对PD的保护作用机制，主要探讨敛肝熄风止颤方是否能改善6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的PD模型大鼠中脑黑质神经细胞的凋亡情况，并观察是否通过ERS 介导的GRP78/calpain/Caspase-12信号通路对多巴胺能神经元起到保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年SD大鼠100只，雌雄各半，体重210～240 g，购自广西中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SYXK(桂) 2016-0012。所有大鼠饲养于广西中医药大学SPF动物房。饲养环境为12 h/12 h昼夜交替，室温(25±2)℃，相对湿度(50±2)%。自由进食、饮水。

1.2药物 敛肝熄风止颤方组成如下：乌梅20 g、黄连3 g、白芍20 g、当归10 g、 熟附子10 g、熟地黄10 g、何首乌20 g、川芎10 g、葛根20 g、人参10 g、石菖蒲5 g、天麻10 g、龟板10 g、炙甘草3 g。中药饮片购自广西中医药大学附属瑞康医院药剂科并由其提供正品鉴定。相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡30 min，开始时用水量高过药面2～5 cm。煮沸后，文火30 min，用纱布过滤，倒出药汁，再将药材量8倍水倒入药材中，煮沸后，文火30 min，将两次的药汁合并，浓缩至1.06 g/ml。大鼠灌胃药液的剂量按照人/鼠公斤体重的等效剂量计算。

1.3试剂与仪器 6-OHDA、阿扑吗啡(APO)试剂盒均购自美国Sigma公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司；GRP78一抗抗体、calpain一抗抗体、Caspase-12一抗抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。低温台式离心机(Eppendorf公司，美国)，酶标自动分析仪(BioTek公司，美国)，电泳槽、转膜仪、凝胶成像系统、PCR扩增仪(Bio-rad公司，美国)，脱色摇床、电子分析天平、超薄切片机(Leica公司，德国)，H-7500型透射电子显微镜(日本奥林巴斯公司)，TL-251603型大鼠脑立体定位仪(Stoelting公司，美国)。

1.4实验分组与模型制备 分组：将100只SD大鼠随机分为假手术组15只，造模组85只，造模组接受PD模型制备，将成模的60只大鼠按体重结合旋转圈数随机分为模型组、敛肝熄风止颤方低剂量组(0.36 g/kg)、中剂量组(0.72 g/kg)及高剂量组(1.44 g/kg)(简称低剂量组、中剂量组、高剂量组)各15只。模型制备：采用6-OHDA 脑左侧纹状体立体定向注射制备PD大鼠模型，参考文献〔4〕，以10%水合氯醛(35 ml/kg)给予大鼠腹腔注射麻醉。根据大鼠脑立体定位图谱〔5〕，准确定位左侧纹状体坐标，于左侧纹状体部位注射溶解有抗坏血酸的6-OHDA(5 μg/μl)，术后予青霉素肌肉注射预防感染。假手术组注射等体积的0.02%抗坏血酸生理盐水。术后第2周开始将造模大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)进行旋转行为测试。观察30 min内大鼠旋转圈数，若大鼠恒定右转，转速>7圈/min或30 min内旋转圈数>210圈表明PD造模成功。

1.5给药方法 根据人/鼠公斤体重的等效剂量计算方法，本研究敛肝熄风止颤方生药量为7.5 g/kg，去药渣合并药液后对药汁进行浓缩，最终药液浓度为1.06 g/ml。随后对中药组给予低、中、高剂量敛肝熄风止颤汤，分别相当于按人和动物体表面积比率换算的临床等效剂量的1/2、1、2倍，各给药组灌胃给药，假手术组及模型组接受等容积生理盐水灌胃。1次/d，给药4 w。

1.6组织病理学苏木素-伊红(HE)染色 末次给药后的次日，每组取5只大鼠，参考文献〔4〕，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)深度麻醉后进行心脏灌流。取出完整脑组织，固定于4%多聚甲醛中24 h。然后梯度脱水，石蜡包埋，根据脑立体定位图谱〔5〕，将蜡块先快速厚切，确认切到黑质部位后，调整片厚为4 μm。每只大鼠黑质部位各取5张切片，用于组织病理学HE染色检测。参考文献〔6〕进行HE染色。

1.7RT-聚合酶链反应(PCR)检测GRP78、calpain、Caspase-12 mRNA表达 每组取5只大鼠断头取脑，迅速分离出中脑黑质组织，参考文献〔7〕，按照 TRIZOL说明书提取总RNA。取1 μg的总RNA，根据反转录试剂盒说明书，反转录合成cDNA，-80℃保存。按照PCR扩增试剂盒说明书，建立PCR体系。在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应。引物序列为GRP78：正义链：5′-TGCAGCAGGACATCAAGTTC-3′,反义链：5′-TACGCCTCAGCAGTCT CCTT-3′;calpain：正义链：5′-GGAAGAAGATGAA GATGATGAG-3′,反义链：5′-TTGCTGAGGTGGATGTTG-3′;Caspase-12：正义链：5′-TGCCAATTCCGACA AACAGC-3′,反义链：5′-TGGATTCTGATGCAGA AGATGGT-3′;β-actin：正义链：5′-GCTCCTCCTGAGCGCAAGT-3′反义链：TCATCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3′。以β-actin作为内参对照，利用PCR试剂盒对各组大鼠脑黑质中GRP78、calpain、Caspase-12 mRNA 的表达水平进行检测，基因的相对表达量用 2-ΔΔCt法计算。

1.8Western印迹检测GRP78、calpain、Caspase-12蛋白表达 每组取5只大鼠，取脑，快速分离中脑黑质组织，参考文献〔8〕将黑质组织加裂解液冷冻匀浆，离心10 min，上清液利用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液水浴锅中煮沸10 min后，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，取出SDS-PAGE凝胶，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，转膜完成后的 PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST中在室温下封闭1 h。弃封闭液后加入一抗抗体〔GRP78(1∶1 000)、calpain(1∶500)、Caspase-12(1∶1 000)进行孵育，于摇床上4℃振摇过夜；次日弃去一抗，TBST洗3次，每次5 min，加入相应的二抗中(均1∶2 000)室温条件下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。将滤膜放入配好的显色液中反应1 min，应用 Image-Pro Plus 图像分析软件进行半定量分析。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1敛肝熄风止颤方对6-OHDA大鼠损伤侧黑质神经细胞形态学的影响 各组脑黑质HE染色结果显示，假手术组脑黑质细胞数目较多，形态结构基本正常。模型组脑黑质细胞数目较少，轮廓形态不清晰，部分神经元发生固缩，胶质细胞浸润。与模型组比较，敛肝熄风止颤方中、高剂量组神经细胞数目明显增多，轮廓形态较之清晰，神经胶质细胞少量浸润；而低剂量组脑黑质可见部分神经细胞发生固缩，中量神经胶质细胞浸润，见图1。

图1 各组脑黑质神经元形态学(HE染色，×200 )

2.2各组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12 蛋白浓度变化及mRNA表达 与假手术组比较，模型组、低剂量组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA表达显著升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，中、高剂量组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA表达和低剂量组calpain蛋白及mRNA表达均显著下降(P<0.01，P<0.05)，而低剂量组脑黑质 GRP78、Caspase-12蛋白及mRNA表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表1。

1～5：低剂量组、中剂量组、高剂量组、假手术组、模型组图2 各组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12 蛋白表达

表1 各组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12蛋白水平及mRNA表达比较

3 讨 论

PD属于中医“颤证”范畴。颤证根据伤寒六经辨证，病在厥阴，以肝脏为首要脏腑。肝主疏泄，疏泄太过，肝风内动，则发为震颤；肝主藏血，濡养筋脉，厥阴脏虚，筋失濡养，则筋脉拘急，发为肢体僵直少动。故颤证的这两大主症均符合厥阴病的主要病机〔9〕。可见厥阴脏虚、肝脏功能失调贯穿于颤证发病的全过程，是颤证病变过程中的重要病理生理学机制。因此，敛肝熄风，养血濡筋法是治疗颤证的关键治则，并且要贯穿于颤证治疗的始终〔10〕。敛肝熄风止颤方(原名：PD2号科研方)源自《伤寒论》厥阴病主方乌梅丸，经过多年临床应用，对早中期PD疗效显著，对晚期PD患者也有一定疗效〔11～13〕。

有研究曾对敛肝熄风止颤方的神经保护作用机制进行初步探讨，发现敛肝熄风止颤方能改善PD模型大鼠行为学症状，增强抗氧化应激能力，增加黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达，抑制神经细胞凋亡〔14，15〕。此外还发现敛肝熄风止颤方可能通过调节B细胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相关X蛋白(Bax)的比值，抑制黑质多巴胺能神经元凋亡起到神经保护作用〔16〕。本研究在上述试验基础上进一步探讨敛肝熄风止颤方的神经保护作用机制。

内质网(ER)是一种复杂的细胞器，主要负责膜蛋白、分泌蛋白的折叠和转录后处理。细胞在药物毒性、环境毒物、缺氧、感染等应激条件下，蛋白质在ER内转运障碍，出现错误折叠及或未折叠蛋白在ER腔内的聚集，称为ERS〔17〕。早期ERS发生后机体启动未折叠蛋白反应(UPR)以恢复 ER 内环境稳态，而持续或过强的ERS损伤了ER的功能时，能启动凋亡通路诱导细胞凋亡〔18〕。研究发现，内质网应激在PD发病过程中发挥重要作用〔19，20〕，抑制 ERS 可减少多巴胺能神经元的凋亡，起到神经保护作用，有望成为神经退行性疾病包括PD的治疗靶点〔21〕。ER特有的Caspase-12激活通路是ERS诱发的凋亡途径之一，ERS状态下，Caspase-12 被激活，进而激活下游Caspase-9、Caspase-3 级联反应，介导细胞凋亡〔22〕。Caspase-12 的激活启动机制之一是主要通过calpain活化，在ERS时，ER钙平衡打乱，细胞内钙离子水平升高引起calpain活化，剪切定位于ER膜上的Caspase-12 前体，Caspase-12 活化启动Caspase级联反应，从而导致细胞发生凋亡〔23〕。有研究表明ERS GRP78/calpain/Caspase-12 激活通路与 PD 有密切联系〔24〕。因此，利用ERS作为PD治疗的作用靶点，通过抑制ERS来减轻多巴胺能神经元损伤。本文推测通过人为的方式调控ERS中的调节因子GRP78及其下游calpain-Caspase-12信号通路，可减少多巴胺能神经元的死亡，为PD的临床治疗提供一个新的策略。本研究结果提示6-OHDA可引起ERS，激活 GRP78/calpain/Caspase-12通路，导致细胞凋亡发生。

综上，敛肝熄风止颤方可能通过抑制PD模型大鼠中脑黑质神经细胞ERS的损伤，减少GRP78的表达，抑制Caspase-12信号通路的活性，对PD发挥神经保护作用，后期可对相关ERS通路进行更深入的探索。