基于荧光免疫层析技术的孕激素定量检测仪

张长亮，庞春颖，郝浙吉

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

根据《医药论坛杂志》，我国新生儿每年出生数量在1 600～2 000万之间，我国女性自然流产人数在总妊娠人数中占10%～15%［1］。其中，由黄体内分泌不足引起的流产占自然流产的20%～58%，所以对于早期孕妇体内的孕激素各项指标的监测具有重要意义。目前，对于孕激素的检测主要采用化学免疫发光技术和胶体金免疫技术［2］。化学免疫发光技术检测精度高，技术成熟，但检测系统复杂，常用于医院大型检测设备，如罗氏COBAS 8000化学发光免疫分析仪、贝克曼DXI800免疫分析仪。胶体金免疫技术基于胶体金的显色反应，仪器便携性强，但只能进行定性或半定量检测，达不到临床检测指标浓度的需求。

荧光免疫层析技术［3］在定量检测领域拥有良好的应用前景，该检测方法主要包括光电检测法和成像式检测法。成像式检测法［4］利用CCD获取荧光图像法，进行荧光提取、分析。徐笑晗等人［5］使用CCD和手持显微镜设计荧光成像检测系统，采集荧光图像，利用图像平均灰度值计算荧光强度。相对于成像式法，光电检测法［6-7］避免了图像采集及荧光信号算法提取等复杂操作过程，通过光电探测器将光信号转换为电信号［8-10］，并通过放大电路、滤波电路对信号进行模拟处理，但该方法对机械扫描稳定性要求高，且容易受到环境光干扰。

本文研发一款基于荧光免疫层析技术的便携式孕激素定量检测仪，设计共聚焦式光学检测光路系统，有效降低荧光信号的干扰，实现孕激素定量检测系统的设计，改善胶体金类检测仪对孕激素浓度定性或半定量检测问题，实现家用便携式仪器对孕激素浓度的定量检测。

1 荧光免疫层析技术检测原理

荧光免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，该检测技术采用荧光素标记待检测抗原或抗体，检测试纸条以检测T线、质控C线的条形纤维层析材料为固相，测试液为流动相。实验选用的荧光免疫层析检测卡采用双抗体夹心法研制，检测时将待检测液体滴加至样品垫，检测液中的待检测物与玻璃纤维样品垫上的荧光标记物结合，被荧光标记物标记的抗原经毛细管作用流经硝酸纤维素膜（NC膜），流经检测T线处时，结合物中的检测抗原与抗体Y1相结合，被滞留在检测T线处。未与检测物结合的荧光标记物流经检测T线，到达质控C线处时与抗抗体Y2相结合，滞留在质控C线处。荧光标记物在激发光的照射下，产生微弱的荧光，荧光强度与检测物质浓度成正相关关系，通过检测T线和C线产生的荧光强度，进而计算被检测样品的浓度值，检测原理图如图1所示。

2 孕激素定量检测仪设计

仪器的设计基于荧光免疫层析检测技术，实现激发并检测已滴加样品试剂卡上的荧光信号，通过处理荧光信号实现对孕激素浓度的检测。便携式孕激素定量检测仪主要包括光学系统和电控系统两部分。

2.1 光学系统

光学检测系统的稳定性和可靠性是荧光免疫检测仪的核心保证，其检测精度影响系统最终检测结果，在检测系统的设计中起决定作用。本文设计共聚焦式光学结构的激发与荧光检测光路，结构图如图2所示，可实现激发与检测共光路工作，结构更加简单、光线损失少、抗干扰性强、大幅提高实验检测精度。

图2 共聚焦式光学结构原理图

共聚焦式光学检测光路工作原理如下：电控系统驱动光源产生荧光信号的激发光，激发光经准直镜平行射入检测光路；滤光片滤除特定波长范围以外的杂光，保证激发光源的单色性；二向色镜与激发光线呈45°夹角，将激发光反射到检测卡区域；聚焦镜将激发线汇聚到检测试剂卡上。荧光标记物在激发光的作用下产生荧光信号；荧光经过聚焦镜到达二向色镜，二向色镜对荧光波长的光具有透射作用，荧光信号透过二向色镜；滤光片滤除荧光波长范围以外的杂光；荧光信号经聚焦镜汇聚到光电探测器的接收面，实现对荧光信号的采集；采集到的荧光信号经电控系统进行模拟信号处理。

系统设计数控恒流源驱动电路实现光照强度调节，选用型号为CUN66A1B的UVLED作为激发光源，发射以365 nm为中心波长的激发光；选用型号为FB360-10的激发滤光片，滤除杂光对激发光源的干扰；选用型号为MDSP425R的二向色镜，对波长410 nm波段以下的光线反射率大于95%，对440 nm波段以上的光线透射率大于90%；聚焦镜1孔径为10 mm，焦距为10 mm；采集滤光片选用型号为FB610-10，滤除检测荧光信号波段以外的光线；聚焦镜2孔径为10 mm，焦距为10 mm；选用型号为BPW21的硅光电二极管作为光电探测器，光谱响应范围在350～820 nm，实现荧光信号的接收。本文设计的检测光路结构图如图3所示。

图3 系统检测光路结构图

检测光路设计时考虑到机械结构稳定性及易装调性等因素，透镜间采用隔圈保证间隔尺寸，采用压圈进行固定，镜筒通过环形圈固定座固定于外壳底部。二向色镜采用UV胶固定在L型镜座上，镜座通过螺钉固定于外壳底部，二向色镜与检测光路呈45°夹角。

系统采用固定光学检测结构，通过步进电机推动检测卡移动，检测卡槽的内部设计弹片结构，当检测卡小于检测卡槽宽度时，可通过弹片进行固定，减少因检测时检测卡的不稳定移动造成的干扰。卡槽底座设计图如图4所示。

图4 卡槽底座设计图

系统检测时，检测样品滴加至检测卡样品垫处，将检测卡插入检测卡槽内，通过步进电机推动滑块系统，将检测卡检测条带匀速经过光学检测区域，完成对检测卡待测物质的荧光信号激发与采集工作。光学检测系统整体设计如图5所示。

图5 光学系统整体设计图

2.2 电控系统

电控系统的设计主要包括主控芯片最小系统电路、激发及检测荧光信号电路、信号I/V转换及放大滤波电路、步进电机驱动电路和人机交互接口电路的设计，实现系统控制电路以及与各模块之间的硬件联系。系统硬件电路设计框图如图6所示。

图6 系统硬件电路设计

系统电路的设计中，各功能模块资源分配如下：采用 PA9、PA10的 USART1功能，通过CH340G芯片构成USB转串口一键下载电路，实现程序的调试与下载，触摸屏通信采用跳线帽转换，实现与USB转换电路共用USART1，进行指令发送与接收；采用PA2、PA3的USART2功能，通过SPS3232芯片构成TTL与RS232信号转换，驱动热敏打印机进行走纸打印；采用PG9、PG14的USART6功能，连接扫描模块，TTL电平信号驱动扫描模块工作；采用PA6、PA7的TIM3功能，用于控制步进电机驱动步数以及ADC采样时间控制；采用 PB6、PB7、PB8、PB9的 TIM4功能，产生四路PWM波驱动步进电机运行；采用PF7的ADC3功能，对输入的模拟信号进行12位模数转换；采用PF0、PF1的IIC通信功能，向24C02芯片写入或读取检测数据。

电控系统程序的设计主要包括仪器上电时系统各参数指标初始化，各项指令接收与数据发送，并执行相应功能，实现系统的有序运作。系统上电后，主程序调用初始化函数，对单片机I/O口、复用映射、定时器、串口、中断及中断优先级等参数进行初始化设置。系统对各项参数初始化完成后，进入等待指令模式，并对接收到的指令进行判断，接收到完成指令，并对指令解析，执行相应功能。系统主程序执行的功能主要包括触摸屏通信、用户登录、检测条码信息扫描、步进电机驱动信号输出、荧光信号采集与处理、检测结果保存以及对检测结果进行打印。系统主程序工作流程图如图7所示。

图7 系统主程序流程图

3 实验结果与分析

采用孕激素定量检测仪对孕酮素浓度进行检测与分析，并与美国贝克曼库尔特公司生产的DXI800全自动免疫分析仪作对比分析。本文设计的孕激素定量检测仪实物图如图8所示。

图8 便携式孕激素定量检测系统

3.1 检测物质浓度表达式拟合

为得到检测荧光强度与物质浓度之间的关系，配置 12组浓度为 0、1.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、30.0 ng/mL、40.0 ng/mL、50.0 ng/mL、60.0 ng/mL、70.0 ng/mL、80.0 ng/mL、90.0 ng/mL、100.0 ng/mL的标准液样品，滴入检测试剂卡样品垫检测。根据实验检测到的荧光信号与待测样品浓度的数据，采用最小二乘法进行线性拟合，所得关系表达式为：

式中，y为检测物质浓度；x为荧光强度特征值。线性相关系数R2＞0.99，仪器在 0～100 ng/mL 浓度检测范围内，孕酮素浓度与荧光信号强度有良好的线性关系，可实现对检测物质浓度的计算，其特性曲线如图9所示。

图9 孕酮素浓度与及荧光信号强度特性曲线

3.2 重复性测试

配置标准液浓度为5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、15.0 ng/mL三种浓度指标进行测试，每组测试重复10次，并计算检测样本浓度均值以及标准差。根据重复性变异系数计算公式

式中，CV为变异系数；σ为样本标准差；为样本平均值。计算出三种浓度指标重复性测试变异系数分别为3.7%、2.8%、1.2%，系统变异系数小于4%，其特性曲线如图10所示，具有较好的可重复性，并且随着检测浓度的升高，变异系数越小，系统检测结果越稳定。

图10 样本重复性测试曲线图

3.3 误差测试

根据标定曲线对仪器检测误差进行测试，配置10组浓度的样品进行检测，并与贝克曼检测设备进行对比，计算检测结果的误差，对比结果如表1所示。

表1 孕酮素对比测试数据表

由表1所知，检测结果中误差最大为4.5%，符合医学仪器设计仪器误差不得超过10%的规定。因此，该仪器检测精确度较好、灵敏度高，满足临床应用要求。

4 结论

本文采用光电检测法，设计共聚焦式光学检测结构，研发一款基于荧光免疫层析技术的孕激素定量检测仪，仪器选用STM32F407微处理器作为系统控制核心，实现对女性尿液中孕激素含量的定量检测。实验结果表明，本文设计的便携式孕激素检测仪能够对孕激素指标进行定量检测，并达到临床对指标检测浓度的要求，相对于胶体金检测法，该仪器可实现对孕激素浓度的定量检测。系统具有检测结果准确、稳定性高、尿检无创等优点，具有较高的应用价值和市场发展空间。