K88ac+产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

段强德，庞胜美，朱国强

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；3.江苏省动物重要疫病和重要人兽共患病防控技术国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009）

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia co-li，ETEC）是引起人和畜禽腹泻最重要的细菌性病原之一。黏附素（菌毛黏附素和非菌毛黏附素）和肠毒素（热敏肠毒素和热稳定肠毒素）是其表达的两类主要毒力因子[1-3]。ETEC 在黏附素的介导下，与宿主细胞特异性受体的结合是其引起感染的第一步也是最为关键的一步。热敏肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）属于典型的A1B5 毒素家族，全毒素由一个具有催化活性的A 亚基非共价结合五聚体B 亚基组成。LT 与霍乱弧菌分泌的霍乱毒素（Cholera toxin，CT）在结构、免疫原性、生物学活性以及作用机理上均高度相似[4-5]。其中LTA 亚基具有ADP-核糖基化活性，发挥细胞毒性作用；LTB 亚基具有膜结合功能，能与宿主细胞表面的GM1 神经节苷脂受体特异性结合。LT 毒素诱导腹泻的机理已经研究的比较清楚。首先，LTB 亚基与宿主细胞上的GM1 受体结合。然后，具有ADP-核糖基化活性的LTA 亚基激活腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase，AC），引起细胞内环磷酸腺苷（Cyclic AMP，cAMP）上升，最终使Cl-分泌增加、Na+吸收减少而引起电解质和水平衡紊乱导致机体水样腹泻。

近年来研究发现，LT 除了传统的细胞毒性作用外，在体内、体外均能促进细菌与宿主细胞的早期黏附[6-7]，但是具体机制还不清楚。肠道上皮是抵抗病原微生物侵入肠道的第一道屏障，紧密连接是细胞间最重要的连接方式，可阻碍毒性大分子的通过。其中，紧密连接蛋白是肠道粘膜屏障的重要组成部分。紧密连接蛋白主要包括ZO-1、Occludin 和Clau-dins 蛋白等，对维持肠道黏膜上皮屏障的完整性具有重要作用，也是评价肠道粘膜屏障功能是否发生障碍的重要指标。已有研究表明，霍乱弧菌分泌的CT 毒素能够引起宿主细胞内cAMP 的上升，破坏细胞的屏障结构，从而促进霍乱弧菌对兔子肠上皮细胞的黏附和定植[8-9]。研究发现，ETEC 感染肠道上皮细胞后能够刺激炎性细胞因子的产生[10]，但是LT 是否会刺激肠道上皮细胞炎性因子的分泌，以及破坏肠道屏障进而促进黏附尚不明确。为研究LT 对K88ac+ETEC 致病性的影响，本研究通过构建猪源K88ac+ETEC 菌株eltAB基因缺失株和回补株，并比较缺失株和K88ac+ETEC 野生株与仔猪小肠上皮细胞的黏附能力、诱导IPEC-J2 细胞分泌炎性细胞因子和表达细胞紧密连接蛋白的能力，为进一步阐明LT促进K88ac+ETEC 黏附的分子机制提供重要的依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒及细胞株大肠杆菌C83902 野生株（K88ac+、LT+、STa+、STb+）、表达质粒pBR322 和仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2 均由本实验室保存；λ-Red同源重组质粒pKD3、pKD46 和pCP20 由美国宾夕法尼亚大学兽医学院微生物实验室提供。

1.2 主要试剂胰蛋白酶（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、氯化钠（NaCl）均购自Oxoid 公司；氨苄青霉素（Ampicillin）和氯霉素（Chloramphenicol）均购自北京索莱宝科技有限公司；L-阿拉伯糖购自BBI 公司；T4 DNA 连接酶和Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶购自Thermo Scientific 公司；限制性内切酶EcoRV-HF（High fidelity enzyme）购自NEB 公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Trans 2K plusⅡDNA Marker 购自TransGen 公司；parameterTMcAMP 试剂盒购自R&D systems 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基和0.25%胰酶均购自Gibco公司；TRIzol Reagent 购自Qiagen 公司；SYBR®Premix ExTaqTM试剂盒购自诺唯赞公司。

1.3 缺失株和回补株的构建根据Datsenko 等采用的λ-Red 同源重组技术构建eltAB基因缺失株（C83902 ΔeltAB）[11]。首先以pKD3 质粒为模板，利用引物ΔeltAB-F/ΔeltAB-R（表1）扩增，将携带ΔeltAB基因同源臂和氯霉素抗性Cat基因的PCR 产物转化至携带有质粒pKD46 的C83902 感受态细胞，在含有Amp+和Cm+双抗性平板上筛选阳性克隆，即获得一次重组菌株C83902ΔeltAB::Cat。进一步利用编码Flp 重组酶的温敏质粒pCP20在42 ℃恒温摇床中连续传3代消除Cat抗性基因，以获得C83902ΔeltAB株。利用pBR-LT-F/pBR-LT-R引物通过PCR和测序鉴定。

以提取的C83902 野生株基因组DNA 为模板，pBR-LT-F/pBR-LT-R 为引物（表1），PCR 扩增全长eltAB基因，经DNA 测序鉴定正确后克隆至表达载体pBR322 中，构建重组质粒pBR322-LT。将重组质粒pBR322-LT 电转化至C83902ΔeltAB株感受态细胞，以获得回补株C83902ΔeltAB/pLT，并经PCR 鉴定。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 3 株菌生长曲线的测定将C83902 株和C83902 ΔeltAB株分别接种LB 液体培养基，C83902ΔeltAB/pLT 株接种含Amp+的LB 液体培养基，置于37 ℃，220 r/min 振荡培养，每1 h 取样测定菌液的OD600nm值，记录并重复上述试验3 次，根据OD600nm值绘制3 株菌的生长曲线。

1.5 3 株菌刺激细胞内cAMP 浓度的测定首先将C83902 株、 C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT株培养至对数生长期，然后按照细菌数和IPECJ2 细胞数10：1 的比例共孵育（37 ℃，1.5 h），细胞用预冷的PBS 洗涤3 次后，用1×细胞裂解液裂解。4 ℃600 r/min 离心10 min 后取上清，采用parame-ter-TMcAMP 试剂盒测定3 株菌诱导IPEC-J2 细胞内cAMP的浓度。

1.6 3 株菌与IPEC-J2 细胞的黏附试验将仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2 接种于24 孔细胞培养板，待长满单层细胞时（约3.0×105个/孔），参照文献[12]方法分别进行3 株菌与IPEC-J2 细胞的黏附试验。

1.7 RT-qPCR 检测炎性细胞因子的转录水平将C83902 株、C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT 株的细菌数与IPEC-J2 的细胞数按照10：1 的比例共孵育1.5 h 后，采用TRIzol 提取IPEC-J2 细胞总RNA。反转录成cDNA。再分别以TNF-α-F/R 和IL-8-F/R为引物，采用RT-qPCR 的方法检测炎性细胞因子TNF-α 和IL-8 转录水平的变化。实验设GADPH基因为内参。

1.8 RT-qPCR 检测紧密连接蛋白的转录水平IPEC-J2 细胞处理、RNA 提取和cDNA 合成操作同上。再分别以Claudin-1-F/R、Occludin-F/R 和ZO-1-F/R 为引物（表1），利用SYBR®Premix ExTaqTM（Per-fect Real Time）试剂盒检测闭合蛋白、密封蛋白-1 和闭锁连接蛋白-1 编码基因（Occludin、Claudin-1、ZO-1）的转录水平，分析eltAB缺失对肠道屏障完整性的影响。实验设GADPH基因为内参。

1.9 数据统计与分析数据均表示为±s。利用GraphPad Prism 5.0 软件中Student'st-tests 对数据进行统计分析。P>0.05 代表无显著性差异；P<0.05 代表差异显著；P<0.01 代表差异极显著。

2 结 果

2.1 缺失株及回补株的PCR 鉴定结果分别以C83902 株、C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT 株基因组DNA 为模板，利用鉴定引物pBR-LT-F/pBRLT-R（表1）扩增eltAB基因。结果显示，C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株扩增片段均为1 148 bp，C83902 ΔeltAB株扩增片段为200 bp，大小均与预期一致（图1）。测序结果显示，C83902ΔeltAB株中eltAB基因已经缺失，在同源区域只留下了1 个FLP 重组酶识别（FRT）位点。上述结果表明分别正确构建了eltAB基因缺失株和其回补株。

图1 C83902ΔeltAB缺失株的PCR鉴定Fig.1 Identification of C83902ΔeltAB deletion mutant by PCR

2.2 3 株菌生长曲线的测定结果3 株菌的生长曲线测定结果显示，C83902 株、C83902ΔeltAB株和C83902ΔeltAB/pLT 株在各个时间点的生长速度基本一致（图2），表明eltAB基因的缺失并不影响C83902菌株的生长速度。

图2 3株菌生长曲线的测定结果Fig.2 The bacterial growth curves of three different strains

2.3 IPEC-J2 细胞内cAMP 浓度的测定结果IPECJ2 细胞内cAMP 浓度测定结果显示，C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株 感 染IPEC-J2 细 胞 后，细 胞内cAMP 水平均极显著升高（P<0.01），浓度分别为7.94 pmol/mL 和8.41 pmol/mL，而C83902ΔeltAB株感染后分泌的cAMP 浓度仅为0.84 pmol/mL，与仅加DMEM 的IPEC-J2 细胞内浓度相比无统计学差异，但比C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株感染组极显著下降（P<0.01）（图3）。以上结果表明，C83902ΔeltAB株不能刺激IPEC-J2 细胞内合成cAMP，再次证实了缺失株构建正确。

图3 3株菌感染IPEC-J2细胞后cAMP浓度的测定结果Fig.3 The intracellular cAMP concentration of IPEC-J2 following infection with three strains

2.4 3 株菌与IPEC-J2 细胞的黏附试验结果为了检测eltAB基因缺失对C83902 菌株黏附能力的影响，本研究比较了C83902 株和C83902ΔeltAB株对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2 的黏附能力。结果显示，与C83902 株 相 比，C83902ΔeltAB株 对IPEC-J2 细 胞 的黏附能力极显著降低（P<0.01）。C83902ΔeltAB株的黏附能力仅为C83902 株的20%，而C83902ΔeltAB/pLT 株的黏附能力与野生株相当（图4）。表明LT 能显著促进C83902 株对仔猪小肠上皮细胞的黏附。

图4 3株菌与IPEC-J2细胞黏附的测定结果Fig.4 The result of three strains adherence to IPEC-J2 cells

2.5 IPEC-J2 细胞炎性细胞因子TNF-α和IL-8 mRNA 转录水平的检测结果经RT-qPCR 检测不同菌株感染IPEC-J2 细胞后主要炎性细胞因子的转录水平，结果显示，与C83902 株相比，C83902ΔeltAB株感染IPEC-J2 细胞后，细胞中炎性细胞因子TNF-α和IL-8 基因的转录水平极显著降低（P<0.01），而C83902ΔeltAB/pLT 株感染细胞中TNF-α 和IL-8 基因的转录水平无显著变化（图5）。表明LT 能够显著诱导IPEC-J2 细胞分泌炎性细胞因子。

图5 RT-qPCR检测炎性细胞因子mRNA转录水平的结果Fig.5 Results of RT-qPCR to detect mRNA transcription level of inflammatory cytokines

2.6 IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白mRNA 转录水平的检测结果经RT-qPCR 检测不同菌株感染IPECJ2 细胞后主要紧密连接蛋白基因的转录水平，结果显示，C83902 株、C83902ΔeltAB株和C83902ΔeltAB/pLT 株感染IPEC-J2 细胞后，细胞中紧密连接蛋白基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的转录水平上均无显著变化（P>0.05）（图6）。表明LT 转录不能破坏IPECJ2 细胞的屏障结构。

图6 RT-qPCR检测紧密连接蛋白编码基因mRNA转录水平的结果Fig.6 Detection of mRNA transcription level of tight junction protein coding gene by RT-qPCR

3 讨 论

细菌毒素是许多病原菌重要的毒力因子之一，一种病原菌能够分泌一种或多种细菌外毒素引起机体致病。细菌外毒素能够促进分泌该毒素的病原菌在体外的黏附和体内定植，从而增强病原菌的毒力和致病性。K88ac+ETEC 是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要病原菌，属于非侵袭性大肠杆菌。K88ac菌毛和肠毒素（LT 和ST）是K88ac+ETEC 的两类主要毒力因子。不同的细菌毒素促进病原菌黏附的能力和机制存在差异。肠出血性大肠杆菌（Enterohemor-rhagicE. coli，EHEC）分泌的志贺类毒素2e（Shigaliketoxin2，Stx2e）促进大肠杆菌O157:H7 与肠上皮细胞的黏附主要是通过增加宿主细胞表面的大肠杆菌外膜蛋白受体核仁蛋白（Nucleolinprotein）的表达[13]。霍乱弧菌分泌的CT 毒素促进霍乱弧菌对兔子肠上皮细胞的定植主要是利用其A 亚基的细胞毒性，破坏细胞的屏障结构[10]。本研究同样发现不表达LT 的C83902ΔeltAB株对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2 的黏附能力较表达LT 的C83902 株显著下降，而C83902 ΔeltAB/pLT 株的黏附能力则恢复至野生株的水平。以上结果表明，LT 毒素在体外能够促进猪源K88ac+ETEC 菌株对仔猪小肠上皮细胞的黏附。

K88ac+ETEC 在各种黏附素的介导下首先黏附、定植至仔猪小肠上皮细胞，然后分泌肠毒素引起细胞内cAMP 浓度的增加，进一步破坏机体水、电解质平衡而引起水样腹泻[14]。 鉴于K88ac 菌毛在K88ac+ETEC 致病过程中的重要作用，推测LT 可能通过增加仔猪小肠细胞中K88ac 菌毛受体（IMTGP）的表达而促进其黏附。但是研究发现LT 的表达并不会改变仔猪小肠上皮细胞上IMTGP 受体的表达[15]。仔猪肠道上皮细胞紧密连接在一起，共同构成肠道的物理屏障，可以有效抵御病原微生物的侵入。LT 的A亚基具有很强的细胞毒性作用，LT 是否可能通过破坏肠道上皮细胞的物理屏障结构而促进细菌黏附尚不清楚。K88+ETEC 感染仔猪肠道上皮细胞可以诱导炎性细胞因子IL-6 和IL-8 的产生[8]。本研究发现elt-AB基因缺失后，TNF-α 和IL-8 的转录水平均显著下降，表明LT 可以诱导仔猪小肠上皮细胞分泌炎性细胞因子。机体过度的炎性反应，可能造成组织损伤，破坏上皮细胞屏障结构。但本研究利用RT-qPCR 检测了C83902 株和C83902ΔeltAB株感染后IPEC-J2 细胞中主要连接蛋白Claudin-1、Occludin 和ZO-1 在转录水平的变化，结果显示3 种连接蛋白在mRNA 转录水平上均无变化，可见LT 促进K88ac+ETEC 黏附并不是通过破坏肠道屏障的完整性而实现的。cAMP 浓度测定结果显示C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株诱导IPEC-J2 细胞分泌的cAMP 水平显著高于C83902ΔeltAB株。鉴于cAMP 是机体内重要的第二信使分子，作用广泛，据此推测cAMP 浓度的上升可能影响菌株的生长，但本研究发现cAMP 的产生并不会影响菌株的生长速度。因此，cAMP 具体是如何促进K88ac+ETEC 菌株黏附的分子机制有待进一步的研究。

本研究证明了ETEC 产生的LT 毒素在体外能促进K88ac+ETEC 菌株对仔猪小肠上皮细胞的黏附和炎性细胞因子的分泌，有利于进一步加深对LT 毒素致病机理的认识，同时为防控K88ac+ETEC 感染引起的新生仔猪和断奶仔猪的腹泻提供了新的策略。