miR-1243通过靶向hnRNPA2B1调控肝癌HepG2细胞增殖和迁移

韩建涛，谢兴旺（武汉市第三医院首义院区 肝胆胰外科，湖北 武汉 430060）

肝癌是全球第五大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因[1]。尽管近年来在诊断和治疗方面取得了较大的进展，但肝癌患者的长期预后依然很差，且晚期肝癌患者的5年生存率小于5%。肝内复发和转移是肝癌治疗的主要困难和挑战，也是导致肝癌患者预后不佳的关键原因[2]。然而，肝癌复发和转移的分子机制尚未完全阐明。一些研究[3-4]表明，多种微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在包括肝癌在内的肿瘤中异常表达，其在转录后或翻译水平负调控基因表达，进而参与调控细胞增殖、迁移等细胞恶性生物学行为。miR-1243 是研究较少的一种miRNA，已被证实在甲状腺乳头状癌[5]、胰腺癌[6]、胶质瘤[7]中低表达，目前并无miR-1243在肝癌中的研究。核不均一核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2B1）属于hnRNPs 家族，是一种重要的RNA 结合蛋白，参与调节前体RNA 的选择性剪接、RNA 核转运、翻译等过程。hnRNPA2B1 在乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、肝癌[10]等多种肿瘤中呈高表达，抑制hnRNPA2B1 表达可抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为。本研究将探讨miR-1243 是否靶向hnRNPA2B1调控肝癌HepG2 细胞的增殖和迁移，为寻找肝癌诊断和治疗的靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI 1640 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清和青、链霉素均购自武汉尚恩生物技术有限公司。miR-1243 模拟物（miR-1243 mimic）及其阴性对照miR-NC、miR-1243 抑制物（anti-miR-1243）及其阴性对照anti-miR-NC、hnRNPA2B1过表达重组载体质粒（pc-hnRNPA2B1）及其空载体质粒（pcDNA3.1）均购自广州锐博生物公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen 公司。TRIzol 试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Super Mix均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CCK-8试剂盒、RIPA 裂解液均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，BCA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗人hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2 抗体及HRP偶联的山羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 组织样本收集与细胞培养

收集2019 年1 月至2021 年8 月在武汉市第三医院首义院区手术切除的40例肝癌患者的肝癌组织及其癌旁组织，经病理医师诊断证实均为肝细胞癌。所有患者均未接受过化疗、放疗或靶向治疗，并签署了知情同意书。该研究方案得到本院伦理委员会的批准（批准号：20171259）。

人正常肝QSG-7701细胞与肝癌HepG2、Hep3b、HuH-7细胞均由北纳生物公司提供。QSG-7701细胞的基础培养基为RPMI 1640，Hep3b、HuH-7、HepG2细胞的基础培养基为DMEM，所有培养基均含10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞置于在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 细胞分组与转染

取对数生长期的HepG2 细胞进行转染实验，分为对照组（不转染）、miR-NC 组（miR-NC 转染细胞）、miR-1243 mimic 组（miR-1243 mimic 转染 细胞）、miR-1243 mimic+pcDNA3.1 组（miR-1243 mimic和pcDNA3.1 共转染细胞）、miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1组（miR-1243 mimic和pc-hnRNPA2B1共转染细胞）。转染实验严格按照LipofectamineTM2000说明书进行，转染24 h后收集各组HepG2细胞备用。

1.4 qPCR 法检测肝癌组织和细胞中miR-1243 和hnRNPA2B1 mRNA的表达

用TRIzol提取各组肝癌组织、各种细胞和转染后各组HepG2细胞中的总RNA。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。采用SYBR Green试剂进行qPCR实验。qPCR反应条件：预变性95 ℃10 min，95 ℃10 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共40个循环；72 ℃延伸5 min。用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量，以U6 为内参基因，分析miR-1243 表达水平；以GAPDH 为内参基因，分析hnRNPA2B1 mRNA表达水平。所用引物序列：miR-1243 正向引物为 5'-TAGGAGTGAAATAAAG GTCCATCTC-3'，反向引物为5'-CCAAAGCAAAGTA ATAAATAGGCAG-3'；U6正向引物为5'-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；hnRNPA2B1正向引物为5'-AGCGACTGA GTCCGCGATGGA-3'，反向引物为5'-GCAGGATCC CTCATTACCACACAGT-3'；GAPDH正向引物为5'-GAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向引物为5'-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

1.5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-1243 与hnRNPA2B1间的靶向关系

TargetScanHuman 7.1在线网站（http://www.targetscan.org/vert 71）预测miR-1243 与hnRNPA2B1存在结合位点，根据其结合位点序列构建hnRNPA2B1的野生型（WT-hnRNPA2B1）和突变型（MUThnRNPA2B1）载体，然后分别与miR-1243 mimic 或miR-NC 共转染至HepG2 细胞，转染48 h 后收集细胞，检测其荧光素酶活性。

1.6 CCK-8法检测转染后各组HepG2细胞的增殖能力

将转染后各组HepG2 细胞密度调整为1×105个/mL，取100 μL 接种在96 孔板中，每组设置3 个复孔，培养至24、48 和72 h时，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，清除培养液，每孔加入150 μL DMSO试剂。在酶标仪450 nm波长处检测各孔光密度（D）值，以D值表示细胞的增殖能力。

1.7 划痕愈合实验检测转染后各组HepG2细胞的迁移能力

转染后HepG2 细胞以2×105个细胞/孔接种在6 孔板上，待细胞生长至汇合度约80%时，使用无菌吸头进行垂直水平划线，用磷酸缓冲液清洗后，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，然后在光学显微镜下观察各组HepG2细胞的划痕愈合情况并拍照。划痕愈合率=（1-24 h划痕宽度/0 h划痕宽度）×100%。

1.8 WB 法检测肝癌组织及细胞和转染后各组细胞的hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2蛋白表达水平

将肝癌组织及细胞和转染后各组HepG2细胞用RIPA 裂解液裂解15 min，离心并收集上清液。蛋白质浓度通过BCA 试剂盒进行检测。接着将蛋白样品与加样缓冲液混合，煮沸10 min，用SDSPAGE 分离，转移至PVDF 膜上，使用5%的脱脂牛奶封闭1 h，加入hnRNPA2B1、cyclin D1、MMP-2、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃处理24 h，加入相应的二抗（1∶8 000），室温处理1 h，接着加入ECL试剂显影，最后用BioRad VersaDoc 4000成像系统直接成像，并通过Quantity One软件将条带量化。

1.9 统计学处理

以上主要实验均独立重复3 次。采用SPSS22.0统计学软件对数据进行分析，符合正态分布的计量数据以xˉ±s表示。两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织和细胞中miR-1243 呈低表达而hnRNPA2B1呈高表达

qPCR 和WB 法检测结果（图1）显示，与癌旁组织比较，肝癌组织中miR-1243 明显呈低表达，hnRNPA2B1 mRNA 和其蛋白呈高表达（均P<0.05）；与正常人肝QSG-7701细胞比较，肝癌HepG2、Hep3b、HuH-7 细胞中miR-1243呈低表达、hnRNPA2B1 mRNA和其蛋白呈高表达（均P<0.05）。在HepG2细胞中miR-1243表达水平最低，hnRNPA2B1 mRNA和其蛋白表达水平最高，因此选择HepG2 细胞进行后续转染实验。

2.2 miR-1243与hnRNPA2B1间存在靶向关系且前者负调控后者的表达

TargetScanHuman7.1在线网站（http://www.targetscan.org/vert_71）预测结果（图2A）显示，miR-1243 与hnRNPA2B1 存在互补位点。双荧光素酶报告基因实验结果（图2B）显示，与miR-NC+WT-hnRNPA2B1组比较，miR-1243 mimic+WThnRNPA2B1组相对荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而miR-NC+MUT-hnRNPA2B1 组、miR-1243 mimic+MUT-hnRNPA2B1 组相对荧光素酶活性基本不变（均P>0.05）。WB 法检测结果（图2C 和图2D）显示，与miR-NC组相比，miR-1243 mimic 组hnRNPA2B1 蛋白表达水平显著下降（P<0.05）；与anti-miR-NC 组相比，anti-miR-1243 组hnRNPA2B1 蛋白表达水平显著上升（P<0.05）。这些实验结果表明，miR-1243 与hnRNPA2B1 间存在靶向关系，miR-1243 通过靶向hnRNPA2B1且负调控其表达。

2.3 miR-1243 通过负调控hnRNPA2B1 影响肝癌HepG2细胞的增殖

qPCR 和WB 法检测结果显示，与对照组或miR-NC 组比较，miR-1243 mimic 组HepG2 细胞中miR-1243 表达升高（图3A，P<0.05），hnRNPA2B1 和cyclin D1 蛋白表达减少（图3B、C，均P<0.05），说明在转染的HepG2 细胞中miR-1243 过表达成功，过表达miR-1243可抑制hnRNPA2B1、cyclin D1 表达。与miR-1243mimic组比较，miR-1243mimic+pc-hnRNPA2 B1组HepG2细胞中miR-1243表达下降，hnRNPA2B1和cyclinD1蛋白表达增加（P<0.05）；miR-1243 mimic+pcDNA3.1组HepG2细胞中miR-1243、hnRNPA2B1和cyclin D1蛋白均无明显差异（P>0.05），说明过同时过表达hnRNAPA2B1 和miR-1243 可逆转过表达miR-1243 对HepG2 的抑制作用。CCK-8法检测结果（图3D）显示，与对照组或miR-NC 组比较，miR-1243 mimic 组HepG2 细胞增殖能力下降（P<0.05），miR-1243 mimic+pcDNA3.1组HepG2细胞增殖能力无明显差异（P>0.05）；与miR-1243 mimic+pcDNA3.1 组比较，miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1组HepG2细胞明显升高（P>0.05），说明过表达hnRNPA2B1 可促进HepG2 细胞的增殖。实验结果表明，miR-1243通过负调控hnRNPA2B1表达而影响肝癌HepG2细胞增殖。

2.4 miR-1243 通过负调控hnRNPA2B1 表达影响肝癌HepG2细胞的迁移

划痕愈合实验结果（图4）显示，与对照组或miR-NC组比较，miR-1243 mimic组HepG2细胞的划痕愈合率和MMP-2蛋白表达均明显降低（均P<0.05），表明miR-1243 抑制HepG2 细胞的迁移；与miR-1243 mimic组和miR-1243 mimic+pcDNA3.1组比较，miR-1243 mimic+pc-hnRNPA2B1 组HepG2 细胞的划痕愈合率和MMP-2蛋白表达均明显升高（均P<0.05），说明同时过表达miR-1243 和hnRNPA2B1 可逆转单纯过表达miR-1243 对HepG2 细胞迁移的抑制作用。实验结果表明，miR-1243通过靶向hnRNPA2B1调控肝癌HepG2细胞迁移。

3 讨论

由于肝癌早期症状无特异性且进展迅速，因而导致多数患者在确诊时就已到中、晚期，药物、放射等治疗方式效果不佳[11]。有研究[12]显示，miRNA可参与调控肝癌的发生发展进程，能够作为生物标志物在肝癌的诊断和预后中起作用。

QIAN 等[13]研究发现，miR-1243在舌鳞癌细胞中表达降低，其过表达能挽救circ_0043265对SCC25和Cal27 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。沉默circ_0002570 表达可通过靶向miR-1243 抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成能力[14]。在PTC中，miR-1243 的低表达与淋巴结转移、TNM 分期显著相关，而且miR-1243 过表达可抑制其癌细胞的增殖和迁移能力[15]。本研究结果显示，miR-1243在肝癌组织和其细胞Hep3b、HuH-7、HepG2中的表达水平显著低于其癌旁组织和人正常肝QSG-7701细胞（均P<0.05），说明miR-1243可能作为分子标志物参与肝癌的发生发展。本研究通过转染miR-1243 mimic 发现，miR-1243 表达明显升高，HepG2细胞增殖能力和划痕愈合率明显降低（均P<0.05），提示miR-1243对肝癌HepG2细胞的增殖和迁移能力有明显的抑制作用。

Cyclin D1、MMP-2 分别是与细胞增殖和迁移相关的蛋白，可作为标志物评估细胞的增殖、迁移水平。Cyclin D1可调节DNA复制过程，MMP-2属于基质金属蛋白酶家族，两者下调表达可使细胞增殖、迁移能力降低，进而减缓肝癌的发展进程[16]。本研究结果显示，miR-1243 过表达后cyclin D1、MMP-2 蛋白表达显著下降（P<0.05），进一步说明miR-1243 通过抑制cyclin D1、MMP-2 蛋白表达抑制肝癌HepG2 细胞的增殖和迁移。

本研究的实验双荧光素酶报告基因实验证实miR-1243 可靶向hnRNPA2B1 并抑制其表达。故本研究推测miR-1243 通过调控hnRNPA2B1 表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。hnRNPA2B1在结肠癌中表达上调，并通过调控MAPK 途径促进结肠癌细胞增殖，调节细胞周期和凋亡[17]。hnRNPA2B1 是头颈癌中的致癌基因，可促进头颈癌细胞的EMT 进程[18]。敲减hnRNPA2B1 通过下调Lin28B 表达抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移能力并促进细胞凋亡[19]。而在肝癌中，敲减hnRNPA2B1 表达可激活PI3K/AKT 信号通路进而抑制细胞增殖[20]。本研究结果显示，肝癌组织和细胞中hnRNPA2B1 mRNA 和蛋白表达水平明显升高，这与吴桐等[20]的研究结果一致，提示hnRNPA2B1 的表达失调与肝癌进展有关。此外，双荧光素酶报告基因实验和WB 法结果显示，miR-1243 靶向且负调控hnRNPA2B1蛋白表达。进一步研究发现，在miR-1243过表达的基础上继续过表达hnRNPA2B1，HepG2细胞增殖、迁移能力及cyclin D1、MMP-2 蛋白表达水平均显著升高（均P<0.05），提示hnRNPA2B1 过表达可逆转miR-1243 对肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响，其与抑制cyclin D1、MMP-2蛋白表达有关。

综上所述，本研究首次证实了miR-1243 在肝癌细胞增殖和迁移中的作用，miR-1243 在肝癌组织和细胞中低表达，miR-1243 过表达对HepG2 细胞的增殖、迁移有抑制作用，其机制与靶向抑制hnRNPA2B1表达有关，为肝癌的靶向治疗提供了新的实验依据。