整合素连接激酶在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其对KYSE-150细胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤生长的影响

马晓丽，高艳，魏瑜，曹雷雨，张周华，张莉（.新疆医科大学第一附属医院 综合内四科，新疆 乌鲁木齐 830054；.新疆医科大学 第一临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830054）

目前，食管癌为全球高发恶性肿瘤之一。根据全球肿瘤数据（Globocan 2012）分析[1]显示，2012年全球食管癌的发病率位居第八位。2015 年，有数据[2‑3]显示，食管癌发病率和病死率均居第四位。由于食管癌患者早期临床表现不明显，且缺乏有效的早期筛查及诊断方法，大部分食管癌患者确诊时已为中晚期，无手术机会，五年生存率较低。对于食管癌的治疗，临床上仍采用放疗、化疗等综合治疗[4]，治疗手段比较单一，缺乏有效的靶向及免疫治疗手段。在中国，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占食管癌病例数的90%以上。整合素 连接激 酶（integrin‑linked kinase，ILK）是HANNIGAN 等[5]于1996 年发现的一种丝氨酸/甲硫氨酸蛋白激酶。既往研究[6]发现，ILK 是整合素和生长因子受体介导的信号转导途径中的重要信号蛋白，在调节细胞黏附、凋亡、增殖、迁移、细胞周期、肿瘤形成及胚胎发育等过程中起着重要作用。ILK 参与了肿瘤的发生和发展，在一些恶性肿瘤中表达上调，如结肠癌[7‑8]、胶质瘤[9‑11]等。但目前关于ILK 在ESCC方面的研究甚少，本研究将探讨ILK的异常表达对ESCC细胞生物学行为的影响，进一步深入研究ILK在肿瘤中发挥的作用，从而为ESCC的精准诊疗提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象的一般资料

检测ILK 所用的150 点组织芯片（目录号为HEso‑Squ150CS‑02）购自上海芯超生物科技有限公司。组织芯片中ESCC和配对的癌旁组织标本，选取2012年1月至2014年12月手术切除并经病理证实的75 例ESCC 患者。纳入患者术前均未接受放化疗及其他抗肿瘤辅助治疗，病理明确诊断为ESCC。收集患者的病理资料，包括年龄、性别、病理诊断、病理分级、T 分期、淋巴结转移情况、远处转移情况和TNM分期（AJCC第7版）等临床病理资料。75例ESCC组织芯片在免疫组织化学染色中无脱落，组织芯片排列整齐、背景清洁。

1.2 细胞、实验动物及主要试剂

ESCC 细胞EC9706、ECA109、TE‑1、KYSE‑150购自上海吉凯基因化学技术有限公司细胞保存中心。裸鼠（4周龄BALB/c）购自上海灵畅生物科技有限公司[动物合 格证号：SCXK（沪）2018‑0003]。DMEM培养基、青‑链霉素、胎牛血清、胰蛋白酶均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzol试剂盒购自上海普飞公司，qPCR试剂盒和逆转录试剂盒均购自广州锐博公司，MTT 试剂盒购自美国Genview公司，凋亡试剂盒购自美国eBioscience公司，流式细胞分析仪（CantoⅡ）购自美国BD公司，WB检测试剂购自上海鼎国生物技术有限公司，酶类试剂购自美国NEB公司，WB所用一抗ILK兔抗人抗体购自英国Abcam公司，内参β‑actin抗体购自美国Santa Cruz公司，兔二抗、鼠二抗均购自美国CST 公司，BCA 蛋白定量试剂盒、ECL发光剂均购自美国Thermo公司。

1.3 免疫组织化学染色法检测ESCC 组织中ILK 蛋白的表达

脱蜡前将组织芯片在60 ℃恒温箱中烘烤30 min，二甲苯脱蜡、无水乙醇水合、PBS 冲洗3次（5 min/次）。抗原用乙二胺四乙酸抗原修复液修复，过氧化氢溶液室温封存30 min，加入牛血清蛋白于37 ℃封闭30 min，PBS 洗涤，加入稀释型抗ILK 兔抗人多克隆抗体，4 ℃过夜。次日，洗去残液，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃反应30 min，用DAB显色剂洗涤，苏木素复染，经脱水、透明、封片处理后在显微镜下观察。ILK 表达情况主要依据抗体的细胞质、细胞膜染色强度和染色阳性率来评价，其中染色强度评分标准为0分（阴性）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3 分（棕褐色），染色阳性率评分标准为0 分（阴性）、1 分（＜25%）、2分（25%～＜50%）、3分（50%～＜75%）、4 分（≥75%）。染色分数=染色强度评分×染色阳性率评分，以0～3分为低表达，4～12分为高表达。

1.4 慢病毒载体构建

利用Chromas 靶序列分析软件设计针对目的基因的干扰序列，针对ILK 的干扰序列为5'‑CGAAGC TCAACGAGAATCA‑3'。随后合成具有干扰序列的单链DNA 寡核苷酸（购自南京金斯瑞生物科技公司），将其在最终浓度为20 μmol/L的退火缓冲液中溶解。消化GV115载体（购自上海吉凯基因公司）并将其线性化，连接双链寡核苷酸与线性化载体，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。采用聚合酶链反应鉴定阳性克隆（TaKaRa公司，货号R001A），进行保存和测序，选择测序结果与靶序列完全一致的克隆用于质粒抽提。随后，将质粒包装成病毒（由上海吉凯基因公司完成），阴性对照病毒滴度为5×108TU/mL，目的基因干扰病毒LV‑ILK‑RNAi滴度为4×108TU/mL。

1.5 细胞培养与干扰慢病毒感染

所有细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基中置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，取对数生长期KYSE‑150细胞接种于6 孔板中，待细胞汇合度达20%左右，将阴性对照和LV‑ILK‑RNAi 病毒以MOI=20 加入到KYSE‑150 细胞中。将细胞分组处理：shILK 组细胞感染目的基因干扰慢病毒、shCtrl组细胞感染阴性对照病毒。感染16 h 后更换新鲜培养基，在感染72 h后，荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况。

1.6 WB 法检测KYSE‑150 细胞中ILK 基因的敲降效率

收集2 组细胞（shCtrl 和shILK），RIPA 裂解液裂解细胞，离心后取上清液用BCA 法测定蛋白浓度。进一步行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用湿转法把蛋白转移至硝酸纤维素膜上，聚偏氟乙烯薄膜用5%脱脂奶粉液封闭，室温封闭1 h。PBS 清洗3次，5 min/次。加入一抗ILK 抗体（稀释比1∶500）和β‑actin 抗体（稀释比1∶5 000）4 ℃反应过夜。次日，用PBS 清洗多余抗体3 次，5 min/次。加入对应二抗（稀释比1∶10 000），室温反应1.5 h。用PBS清洗多余抗体3次，每次5 min。随后加入发光底物，反应30 s，ECL 法结合X 光片显影，使用ImageJ 软件统计目标蛋白质的积分光密度值，并和β‑actin 进行相比较，统计目标蛋白质的表达丰度。

1.7 qPCR法检测敲降ILK对KYSE‑150细胞中ILK mRNA表达的影响

收取各组细胞样品，使用TRIzol 试剂裂解并抽提总RNA。利用PrimeScript RT 试剂盒在标准条件下产生随机引物，将500 ng的总RNA反转录为10 μL的最终体积。反应条件是95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s、59.2 ℃退火与延伸30 s，共35 个循环。结果用GAPDH的表达量标准化。用ILK和GAPDH的引物进行qPCR，ILK 基因的上游引物序列：5'‑GAC GACATTTTCACTCAGTGC‑3'，下游引 物序列：5'‑ACGGTTCATTACATTGATCCGTG‑3'；GAPDH 上游引物序列：5'‑TGACTTCAACAGCGACACCCA‑3'，下游引物序列：5'‑CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA‑3'。采用ABI7500 平台对qRCR 的相关信息进行统计分析（2‑ΔΔCt法）。

1.8 MTT 法检测敲减ILK 对KYSE‑150 细胞增殖的影响

取各组对数生长期的细胞，稀释成单细胞悬液，每孔100 μL 接种于96 孔 板（2×103细 胞/孔），在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。分别在细胞贴壁后0、24、48、72、96 和120 h 向每孔加入MTT 液20 μL至其终浓度为5 mg/mL，继续培养4 h。去掉上清液，加入二甲基亚砜150 μL，震荡2～5 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定490 nm 波长下的光密度（D）值，以D值代表细胞增殖水平。以时间为横坐标，D值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.9 细胞克隆形成实验检测敲降ILK对KYSE‑50细胞克隆形成能力的影响

取处于对数生长期的KYSE‑150 细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液接种于6孔板培养板上，细胞接种密度为4×103个/孔，每组设3 个复孔。37 ℃、5%CO2条件下培养2 周，间隔3 d 更换培养液1 次。用4%多聚甲醛固定30～60 min 后，用结晶紫染色10～20 min。晾干、拍照、计算细胞克隆数及形成率，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。进行3 次独立的重复实验。

1.10 FACS 检测敲降ILK 对KYSE‑150 细胞凋亡的影响

取对数增长期的shCtrl 组及shILK 组细胞，用胰蛋白酶进行消化，完全培养基进行重悬，制备成细胞悬液。与上清细胞收集同一5 mL离心管中，1 000×g离心5 min，弃上清，以4 ℃预冷的D‑Hanks液洗涤细胞沉淀。结合缓冲液洗涤细胞沉淀，加入10 μL Annexin Ⅴ‑APC染色进行上机检测细胞凋亡。利用guava InCyte软件对结果进行分析。

1.11 裸鼠体内成瘤实验检验敲降ILK对KYSE‑150移植瘤生长的影响

将4周龄雌性BALB/c小鼠随机分成对照组（NC组）和干预组（KD 组），每组10 只。制备KYSE‑150细胞后（细胞接种量为2×106个，悬于200 μL PBS中），注射到动物皮下。观察成瘤情况，每4 d用游标卡尺测量瘤块最长和最短直径，计算肿瘤体积，肿瘤体积=（瘤体长径×瘤体短径2）/2。皮下注射28 d后或根据实际成瘤情况及动物福利伦理规定，用过量的2%戊巴比妥钠对实验动物实施安乐死，再进行颈椎脱臼确认死亡，剥离移植瘤，计算移植瘤体积。将取出的肿瘤称量瘤质量，并放于多聚甲醛中固定，液氮冷冻后于-80 ℃保存。

1.12 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件对所得结果进行处理，用Prism GraphPad 9.0 软件绘图。以χ2检验分析ILK的表达水平及其与临床病理特征的关系，符合正态分布的计量资料以的形式表示，计数资料以频数和百分比的形式表示；两组间的差异比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ILK蛋白在ESCC组织中呈高表达

免疫组化染色结果（图1）显示，ESCC 组织中ILK染色多为阳性，其在ESCC组织中的表达水平高于癌旁组织[93.3%（70/75）vs29.3%（22/75），χ2=64.768，P＜0.05]。

2.2 ILK表达与ESCC患者特征的关系

χ2检验结果（表1）显示，ILK 高表达与淋巴结转移有关联（P=0.001），而ILK 高、低表达组患者的年龄（P=0.645）、性别（P=0.588）、T 分期（P=0.898）、远处转移（P=0.536）、分化程度（P=0.966）、临床分期（P=0.791）等患者特征间的差异均无统计学意义。

表1 ILK表达与ESCC患者临床参数的关系（N=75）

2.3 ILK mRNA在KYSE150细胞中呈现高表达

qPCR实验结果（图2）显示：ESCC细胞ECA109、TE‑1、EC9706、KYSE150 中ILK mRNA 的表达水平分别为（1.15±0.58）、（6.06±0.41）、（36.23±23.52）和（995.14±53.42）。以KYSE‑150细胞的ILK mRNA表达水平最高，因此选用KYSE‑150细胞进行后续的实验研究。

2.4 敲降ILK基因抑制KYSE‑150细胞的增殖能力

使用ILK干扰慢病毒感染KYSE‑150细胞，显微镜观察显示，未见细胞有肉眼可见的形态学变化。荧光显微镜观察报告基因GFP的表达情况（图3），荧光率即为阳性感染率。慢病毒感染KYSE‑150细胞3 d后，两组细胞均可见绿色荧光表达，感染效率均在90%以上。

qPCR 实验结果（图4A）显 示，shCtrl 组KYSE‑150细胞中ILK mRNA的表达量约为shILK组的12.8 倍（P＜0.05）。WB 法检测结果（图4B）显示，shILK组KYSE‑150细胞中ILK蛋白表达水平明显下调（P＜0.05），提示ILK 敲降成功。MTT 法检测结果（图4C）显示，shILK组KYSE‑150细胞的增殖能力显著低于shCtrl 组（均P＜0.01]。克隆形成实验结果（图4D）显示，shILK组细胞克隆形成率低于shCtrl组（P＜0.05）。上述结果表明，敲降ILK 的表达可抑制KYSE‑150细胞的增殖能力。

2.5 敲降ILK基因促进KYSE‑150细胞凋亡

细胞凋亡检测结果（图5）显示，shILK组KYSE‑150细胞的凋亡率高于shCtrl 组（P＜0.05）。结果表明，敲降ILK 基因的表达可促进KYSE‑150细胞凋亡。

2.6 敲降ILK基因抑制KYSE‑150细胞裸鼠移植瘤的生长

裸鼠皮下成瘤实验结果（图6）显示，KD 组的裸鼠移植瘤体积及质量均低于NC 组（P＜0.05）。表明敲降ILK 基因的表达明显减缓了皮下移植瘤的形成速度，肿瘤体积也明显减小。实验结果表明，敲降ILK 基因可抑制裸鼠KYSE‑150 细胞移植瘤的生长，提示ILK可能参与了ESCC的发生与发展过程。

3 讨论

ILK 是一种细胞内信号蛋白，具有Ser/Thr 蛋白激酶活性，参与调节多种信号转导通路，包括AKT、GSK‑3β、NF‑κB、Erk 等信号通路[5，12]。ILK 由452 个氨基酸残基组成，相对分子质量为59 000，位于人染色体11Pl5.5～l5.4，基因全长8.8 kb，含有13 个外显子和12 个内含子。ILK 在调节细胞黏附、凋亡、迁移、生长、细胞周期、肿瘤形成及浸润和转移、上皮间质转化等过程中起重要作用[13]。

ILK 参与恶性肿瘤形成，动物实验[14]表明ILK 高表达可导致裸鼠乳腺癌的形成。有研究结果[15]发现，ILK 可能是结肠炎症及肿瘤发生中的分子驱动因子和介质，通过调节结肠炎小鼠模型的炎症反应，从而促进结肠炎相关肿瘤的生长。亦有研究发现，ILK在一些恶性肿瘤中过表达，如乳腺癌[16]、卵巢癌[17]、结直肠癌[18]、膀胱癌[19]等，提示ILK 在肿瘤的发生及进展中起着十分重要的作用。

ILK主要通过参与肿瘤细胞的迁移和黏附、细胞外基质降解以及肿瘤血管生成等促进肿瘤浸润和迁移。PERL 等[20]报道了高表达ILK 能诱导E‑钙黏蛋白的表达减少，降低细胞之间及细胞与基质之间的黏附性，从而促进肿瘤的侵袭和转移。DRIVER等[21]利用qPCR 技术研究南非起源的5 个人类ESCC细胞中ILK 的表达情况及其亚型，分析生长因子对ILK 表达的影响，结果提示EGF 和TGF‑β1 可调节ESCC细胞中ILK的表达。此外，有研究[22]报道，ILK抑制剂QLT0267通过阻止Akt和下游靶标GSK‑3β的磷酸化，可有效阻碍神经胶质瘤细胞中ILK/Akt级联的信号传导，进一步遏制神经胶质瘤细胞生长，说明ILK可能成为未来肿瘤基因治疗的一个靶点。

本研究首先采用免疫组织化学染色法检测ESCC 组织中ILK 的表达情况，结果表明ILK 蛋白在ESCC 组织中的表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），且ILK 高表达 与淋巴 结转移有关联（P＜0.05），提示ILK 可能参与ESCC 发生、发展的过程。其次，从细胞水平通过MTT实验、克隆形成实验发现，敲降ILK 表达后，KYSE‑150 细胞增殖能力、克隆形成能力减弱。表明ILK 基因可能促进KYSE‑150 细胞增殖，由此推测ILK 基因异常表达可能是增加ESCC 恶性程度的一个重要因素。细胞凋亡与许多疾病尤其是肿瘤的发生、发展和转归有着密切的关系。通过FACS 检测抑制ILK 基因表达对KYSE‑150 细胞凋亡的影响，结果发现敲降ILK 基因表达后，相对于对照组，细胞凋亡率升高，故ILK 抑制KYSE‑150 细胞凋亡，可能是促进细胞增殖的一个重要原因。在动物实验中，成功建立KYSE‑150细胞皮下成瘤裸鼠模型，结果发现相对于对照组而言，ILK 干扰组裸鼠瘤体显著偏小，而且生长较为缓慢。结果表明，敲降ILK基因可抑制裸鼠KYSE‑150 细胞移植瘤的生长，提示ILK 可能参与了ESCC的发病过程。

综上所述，本研究从组织水平、细胞水平和动物模型三个层面揭示了ILK 基因敲降可阻碍KYSE‑150 细胞增殖及裸鼠皮下移植瘤的生长，促进细胞凋亡，为ESCC 的早期临床诊断和精准诊疗提供了新策略和新靶点。但目前关于ILK 与其上下游基因的关系及其调控机制尚不清楚，且相关信号通路在ESCC 中的深入研究还有待完成。后续本课题组将更进一步研究ILK 在食管癌发生发展过程中的作用和机制，为ESCC治疗发现新靶点和新机制提供实验基础。