lncRNA SNHG14 通过靶向miR-433-3p 调控甲状腺癌SW579 细胞的恶性生物学行为

马文飚，石博，夏蕾，乜茹，桑子江，马鑫（青海省人民医院 乳甲科，青海 西宁 810001）

甲状腺癌是临床常见恶性肿瘤之一，其主要病理类型为甲状腺乳头状癌，目前临床主要采用手术与放射性碘消融等方法治疗，但其发病率仍逐年升高[1]。早期筛查甲状腺癌并给予及时治疗有助于降低甲状腺癌病死率[2]。研究[3]表明，长链非编码RNA（lncRNA）在甲状腺癌中异常表达并可参与肿瘤发生发展过程。lncRNA SNHG14在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤中呈高表达且发挥致癌基因作用[4‑6]，但SNHG14 对甲状腺癌细胞生物学行为的影响及其具体机制尚不清楚。本课题组利用StarBase 数据库进行预测发现miR‑433‑3p 可能是SNHG14 的靶基因。研究[7]表明，miR‑433在甲状腺癌细胞中呈低表达，过表达miR‑433 可抑制甲状腺癌细胞增殖。本研究主要探讨甲状腺癌组织中SNHG14 与miR‑433‑3p 的表达，采用体外细胞实验检测抑制SNHG14的表达对甲状腺癌SW597细胞的恶性生物学行为的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本的收集及患者的临床资料

收集2017 年10 月至2018 年12 月青海省人民医院收治的20例甲状腺癌患者的癌组织及癌旁组织标本，均经病理证实为甲状腺癌。其中男性10例、女性10例，年龄为50～70岁，中位数年龄为61.33岁。肿瘤直径＞1 cm者8例、≤1 cm者12例；TNM分期为Ⅰ期、Ⅱ期患者共13 例，Ⅲ期、Ⅳ期患者共7 例；发生淋巴结转移者14例，未发生淋巴结转移者6例；肿瘤个数为单个者15例、多个者5例；有侵犯包膜现象者4例，未侵犯包膜者16 例。所有患者均签署知情同意书，本研究方案已获得青海省人民医院伦理委员会批准（批注号为No.2022‑81）。

1.2 实验用细胞与试剂

甲状腺癌细胞SW579 购自美国ATCC 细胞库。SNHG14小干扰RNA（si‑SNHG14）（5'‑UCGUAC UAUCUAGCUACU‑3'）及其对照无意义阴性序列（si‑NC）、miR‑433‑3p模拟物（mimic）（5'‑CGU ACUAGUCAGUCGUA‑3'）及其阴性对照（miR‑NC）、miR‑433‑3p 特异性寡核苷酸抑制剂（anti‑miR‑433‑3p）（5'‑GAUCGAUCGCCGAUCGCCCAUUUUU‑3'）及其阴性对照（anti‑miR‑NC）均购自广州锐博生物公司，反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒均购自大连宝生物工程公司，MTT、凋亡检测试剂盒均购自美国Sigma 公司，兔抗人E‑cadherin 抗体购自美国CST 公司，兔抗人caspase‑3 前体（Pro‑caspase‑3）、抗裂解型caspase‑3（cleaved caspase 3，C‑caspase‑3）、抗Ki67 及 抗N‑cadherin 抗体均购自美国Santa Cruz 公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 分组及细胞转染

将生长至约70%汇合的SW579细胞在Opti‑MEM减血清培养基中培养，利用LipofectamineTM2000试剂进行转染。实验分成6组：si‑NC 组（转染si‑NC）、si‑SNHG14 组（转染si‑SNHG14）、miR‑NC 组（转染miR‑NC）、miR‑433‑3pmimic 组（转染miR‑433‑3p mimic）、si‑SNHG14+anti‑miR‑NC 组（si‑ SNHG14 与anti‑miR‑NC共转染）、si‑SNHG14+anti‑miR‑433‑3p组（si‑ SNHG14 与anti‑miR‑433‑3p 共转染）。转染后，采用qPCR法检测转染后各组细胞中SNHG14和miR‑433‑3p 的表达水平以鉴定转染后的敲减或过表达效果。

1.4 qPCR 检测甲状腺癌组织和细胞中SNHG14、miR‑433‑3p的表达水平

采用TRIzol 法分别提取甲状腺癌组织、癌旁组织和6 组转染后SW579 细胞的总RNA，参照反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒说明书操作，合成cDNA后配制qPCR 反应体系，以cDNA 为模板进行qPCR。PCR参数：预变性95 ℃5 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 个循环；72 ℃终延伸10 min。根据2-ΔΔCt法计算SNHG14、miR‑433‑3p 的相对表达量。SNHG14的正向引物为5'‑GCAACCAGAGCGTGA AGAA‑3'，反向引物为5'‑ACCCGAGCAATGCCA GTA‑3'；GAPDH 的正向引物为5'‑GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT‑3'，反向引物为 5'‑GGCTGT TGTCATACTTCTCATGG‑3'；miR‑433‑3p的正向引物为5'‑AACGAGCTTGTGGCCGACG‑3'，反向引物为5'‑TGCGGCGTTTTGAACGACTGC‑3'；U6 的正向引物为5'‑GTCGTCGAAACTGCTGGG‑3'，反向引物为5'‑TGACGCTGCGTTGGCAAGTC‑3'。

1.5 MTT法检测转染后各组SW579细胞的增殖能力

在96孔板中分别接种6组SW579细胞（3×103个/孔），每组设置3 个复孔，于转染24、48、72 h 后加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），室温下放置4 h后，加入150 μL DMSO 振荡10 min，酶标仪检测光密度（D）值，以D值代表细胞增殖能力。

1.6 流式细胞术检测转染后各组SW579 细胞的细胞周期和凋亡情况

细胞周期检测：取6 组转染后的对数生长期SW579 细胞（1×106个/mL），每200 μL 加入500 μL 预冷PBS，加入70%乙醇3.5 mL，离心后弃上清液，向细胞沉淀中加入RNase A 50 μL，37 ℃水浴30 min，加入PI 染液450 μL，4 ℃处理30 min，应用流式细胞仪检测各组细胞周期。细胞凋亡检测：分别取6组转染后对数生长期SW579 细胞，在500 μL 结合缓冲液中悬浮，按照凋亡检测试剂盒说明书操作，以流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7 Transwell 实验检测转染后各组SW579 细胞的迁移和侵袭能力

侵袭实验中，取40 μL预冷培养液稀释后的人工基膜（metrigel）平铺上室后放置5 h，待晾干后开始实验。迁移实验则不预铺人工基膜。将200 μL对数生长期的转染后各组的SW579细胞（5×104个/mL）加至Transwell 上室，取600 μL 含10%胎牛血清的培养液加至Transwell下室，于培养箱内培养24 h，移除未穿膜细胞后，用多聚甲醛固定侵袭或迁移细胞10 min，1%结晶紫染液染色10 min，显微镜（200 倍）下观察并计数，以随机选取的5个视野中细胞数的平均值为侵袭或迁移细胞数。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证SNHG14与miR‑433‑3p间的靶向结合

采用StarBase 软件预测发现SNHG14 与miR‑433‑3p 的序列间存在结合位点。构建携带野生型SNHG14 基因的载体SNHG14‑WT 和携带突变型SNHG14基因的载体SNHG14‑MUT。取对数生长期SW579 细胞，按转染处理的不同分为4 组：SNHG14‑WT+miR‑NC共转染组、SNHG14‑WT+miR‑433‑3p mimic 共转染组、SNHG14‑MUT+miR‑NC 共转染组和SNHG14‑MUT+miR‑433‑3p mimic 共转染组。转染24 h 后收集SW579 细胞，检测各组细胞中荧光素酶的活性水平。为进一步验证SNHG14 与miR‑433‑3p之间的调控作用，取对数生长期SW579细胞，按转染处理的不同分成4组：pcDNA3.1 组、pcDNA3.1‑SNHG14 组、si‑NC 组、si‑SNHG14 组，转染24 h 后采用qPCR法检测各组细胞中miR‑433‑3p的水平。

1.9 WB法检测转染后各组SW579细胞中E‑cadherin、C‑caspase‑3、Pro‑caspase‑3、Ki67、N‑cadherin蛋白的表达

收集6 组SW579 细胞，在冰上用RIPA 裂解30 min，进行细胞总蛋白抽提，蛋白经SDS‑PAGE 常规分离、转PVDF膜后封闭2 h，分别加入一抗E‑cadherin、C‑caspase3、Pro‑caspase3、Ki67、N‑cadherin（稀 释度均为1∶1 000）后在4 ℃下处理过夜，加入二抗（稀释度为1∶2 000）后在室温下处理1 h，化学发光法曝光显影，各条带灰度值采用ImageJ软件进行分析。

1.10 统计学处理

所有实验均独立重复3 次。采用SPSS21.0 统计学软件分析数据，本研究所有数据均属于计量资料且均符合正态分布，以表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺癌组织中SNHG14呈高表达而miR‑433‑3p呈低表达

qPCR 实验结果显示，甲状腺癌组织中SNHG14的表达水平显著高于癌旁组织（0.25±0.02vs0.86±0.09，P＜0.01），miR‑433‑3p的表达水平显著低于较癌旁组织（0.64±0.06vs0.17±0.02，P＜0.01）。

2.2 敲减SNHG14可抑制SW579细胞增殖且诱导其凋亡

qPCR 实验结果显示，与si‑NC组相比，si‑SNHG14组SW579 细胞中SNHG14 的表达水平显著降低（0.36±0.03vs0.88±0.09，P＜0.05）。MTT 法、FCM 检测结果显示，与si‑NC 组相比，si‑SNHG14 组SW579细胞的增殖能力降低（P＜0.05，图1A），G1 期细胞比例增加、S 期细胞比例减少（均P＜0.01，图1B），细胞凋亡率增加（P＜0.05，图1C）。WB 法检测结果（图1D）显示，与si‑NC组相比，si‑SNHG14组SW579细胞中Ki67、Pro‑caspase‑3 蛋白表达量降低（均P＜0.01），而C‑caspase‑3 蛋白表达量升高（P＜0.01）。这些结果说明，敲减SNHG14 可明显抑制SW597 细胞的增殖能力，并诱导其凋亡。

2.3 敲减SNHG14 表达可抑制SW579 细胞的迁移、侵袭和EMT进程

Transwell 实验结果（图2A）显示，与si‑NC 组相比，si‑SNHG14 组SW579 细胞的迁移细胞数[（68±7.10）vs（152±15.78）个，P＜0.05]与侵袭细胞数[（62±6.33）vs（139±14.21）个，P＜0.05]均显著减少。WB法检测结果（图2B）显示，与si‑NC 组相比，si‑SNHG14组SW579 细胞中E‑cadherin 蛋白表达量显著增加（0.80±0.08vs0.34±0.03，P＜0.05），N‑cadherin 蛋白表达量显著减少（0.27±0.03vs0.88±0.09，P＜0.05）。这些结果说明，敲减SNHG14 表达可明显抑制SW597细胞的迁移、侵袭和EMT进程。

2.4 SNHG14靶向miR‑433‑3p并抑制其表达

StarBase 数据库数据预测结果（图3）显示，SNHG14的3'UTR存在miR‑433‑3p的结合位点。双荧光素报告基因实验结果显示，与SNHG14‑WT+miR‑NC共转染组相比，SNHG14‑WT+miR‑433‑3p mimic 共转染组荧光素酶活性显著降低（0.26±0.03vs1.00±0.10，P＜0.01）。另外，qPCR 检测结果显示，与pcDNA3.1 组比较，pcDNA3.1‑SNHG14 组细胞中miR‑433‑3p 表达明显降低（0.05±0.01vs0.19±0.02，P＜0.01）；与si‑NC组比较，si‑SNHG14组细胞中miR‑433‑3p明显升高（0.51±0.05vs0.18±0.02，P＜0.01），这些结果说明，SNHG14可靶向结合miR‑433‑3p并抑制其表达。

2.5 过表达miR‑433‑3p可抑制SW579细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程，促进其凋亡

qPCR 结果显示，与miR‑NC 组相比，miR‑433‑3p mimic 组SW579 细胞中miR‑433‑3p 的表达水平明显升高（0.46±0.04vs0.18±0.02，P＜0.01），说明转染实验有效地使miR‑433‑3p 在细胞中过表达。MTT（图4A）、FCM（图4B）检测结果显示，与miR‑NC组相比，过表达miR‑433‑3p可使SW579细胞的增殖活力减弱（P＜0.05），G1 期细胞比例增加、S 期细胞比例减少（均P＜0.05）；WB 法检测结果（图4C）显示，与miR‑NC组相比，miR‑433‑3p mimic 组SW579细胞中Ki67、Pro‑caspase‑3、N‑cadherin蛋白表达量均显著降低（均P＜0.01），C‑caspase‑3、E‑cadherin蛋白表达量均显著升高（均P＜0.01）；FCM（图4D）和Transwell实验检测结果（图4E）显示，与miR‑NC 组相比，miR‑433‑3p mimic 组SW579细胞的细胞凋亡率显著增加（P＜0.01），而迁移与侵袭细胞数显著减少（P＜0.01）。这些结果说明，过表达miR‑433‑3p可抑制SW579细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程，且促进其凋亡。

2.6 抑制miR‑433‑3p可部分逆转敲减SNHG14表达对SW579细胞生物学行为的影响

MTT、qPCR、FCM、WB和Transwell实验检测结果显示，与si‑SNHG14+anti‑miR‑NC组相比，si‑SNHG14+anti‑miR‑433‑3p 组SW579 细胞的增殖水平显著升高（P＜0.05，图5A），miR‑433‑3p 的表达水平明显升高（0.51±0.05vs0.26±0.03，P＜0.01），细胞凋亡率和G1期细胞比例减少、S 期细胞比例增高（均P＜0.05，图5B、C），Ki67、Pro‑caspase‑3、N‑cadherin 蛋白表达量升高而C‑caspase‑3、E‑cadherin蛋白表达量降低（均P＜0.01，图5D），迁移与侵袭细胞数明显增加（P＜0.01，图5E）。这些实验结果说明，抑制miR‑433‑3p可部分逆转由敲减SNHG14表达产生的对SW579细胞生物学行为的作用。

3 讨论

部分lncRNA 在甲状腺癌中转录失调并发挥抑癌或促癌基因作用，还可通过充当miRNA 的海绵分子而影响肿瘤的发生发展[8]。既往研究[9‑10]显示，lncRNA CRNDE、lncRNA SNHG15 等在甲状腺癌细胞中异常表达并影响癌细胞的生物学行为。研究[11]显示，SNHG14 在结直肠癌组织和细胞中呈高表达，而抑制其表达可通过调控miR‑519b‑3p/DDX5 轴促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭；SNHG14 在弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中呈高表达，敲低其表达能抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖、迁移和免疫逃逸，并通过调控miR‑152‑3p 影响弥漫性大B 细胞淋巴瘤发生发展进程[12]；SNHG14 通过调节miR‑206/YWHAZ 轴抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡[13]；在非小细胞肺癌中，SNHG14 可使miR‑340 海绵化而发挥致癌功能[14]。最近的研究结果[15]显示，SNHG14 可通过调控miR‑93‑5p 抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示SNHG14 有望成为甲状腺癌潜在标记物。本研究发现，SNHG14在甲状腺癌组织中呈高表达，敲减SNHG14可抑制甲状腺癌SW579 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞于G1期，同时下调Ki67、Pro‑caspase‑3、N‑cadherin 蛋白的表达而上调C‑caspase3、E‑cadherin蛋白表达。提示敲减SNHG14 表达可抑制甲状腺癌SW579细胞增殖及迁移、侵袭，诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。

本研究使用StarBase 数据库数据预测发现，SNHG14 和miR‑433‑3p 的序列上存在相互结合的位点，进一步通过双荧光素酶报告实验证实了SNHG14能够靶向调控miR‑433‑3p 表达，而miR‑433‑3p 在多种癌症表达下调，还可通过介导下游mRNA 影响肿瘤细胞生物学过程[16‑18]。miR‑433‑3p 通过靶向生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor‑bound protein 2，GRB2）抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖与侵袭[19]。人脑胶质瘤中，miR‑433‑3p 通过靶向调控cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP‑response element binding protein，CREB）的表达而抑制胶质瘤细胞生长并增强其化疗敏感性[20]。相关报道[21]指出，miR‑433‑3p 还可作为肝细胞癌早期诊断的生物标志物。有研究[21]显示，miR‑433 在甲状腺癌中低表达，miR‑433 有望成为甲状腺癌潜在标记物。本研究结果显示，miR‑433‑3p 在甲状腺癌组织中呈低表达，过表达miR‑433‑3p 会抑制SW579 细胞的增殖、迁移和侵袭细胞数相应减少，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1期，同时下调Ki67、Pro‑caspase‑3、N‑cadherin蛋白的表达而上调C‑caspase‑3、E‑cadherin 蛋白的表达，说明SNHG14对甲状腺癌细胞生物学行为的调节作用是通过靶向miR‑433‑3p来实现。

综上所述，SNHG14在甲状腺癌中的表达显著高于癌旁组织，敲减SW579 细胞中SNHG14 的表达可通过上调miR‑433‑3p 来抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭而促进细胞凋亡。本研究结果为进一步阐明甲状腺癌病理的分子机制和探寻其生物标志物提供了新线索。但miR‑433‑3p是否可调控相关靶基因而参与甲状腺癌发生发展过程尚需进一步探究。