超高效液相色谱指纹图谱与化学模式识别马鞭草药材质量评价研究

张志鹏 邓李红 王寿富 黄梦婷 李 玲 魏 梅

广东一方制药有限公司，广东佛山 528244

马鞭草为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinatis L.的干燥地上部分[1]，多年生草本植物，花期在每年的6～8 月，在中国主要分布于江苏、河南、贵州等地。马鞭草主要含环烯醚萜类、黄酮类、挥发油类等化学成分[2-5]，具有镇咳、抗炎、抗肿瘤等药理作用[6]，其中抗炎镇咳的有效成分主要为环烯醚萜类和黄酮类[7]。《中国植物志》[8]中记载马鞭草植物形态为茎四方形，多分枝，叶对生，穗状花序顶生和腋生等。目前，学者们多对马鞭草整株药材进行含量测定和指纹图谱的研究[9-14]，而本研究通过测定马鞭草药材、根、主茎、侧枝、叶、花穗的指纹图谱，对不同形态部位的色谱图进行化学模式识别研究，为保证马鞭草药用的科学合理性提供实验数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XP26 型、ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；111B 型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超纯水机（默克密理博实验设备有限公司）。

1.2 材料

5-羟基马鞭草苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18110104，纯度＞98.0%）；马鞭草苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：M-042-180517，纯度＞99.36%）；毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201714，纯度＞92.5%）；甲醇、乙腈（色谱纯，默克股份有限公司）。

11批马鞭草药材（编号：A1～A11）经魏梅主任药师鉴定为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinatis L.，产地信息见表1。将11 批马鞭草药材不同部位分开，分别得根（编号：B1～B11）、主茎（编号：C1～C11）、侧枝（编号：D1～D11）、叶（编号：E1～E11）、花穗（：编号F1～F11）。

表1 药材产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性

Waters HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序：0～2 min，2%→10%A；2～12 min，10%→18%A；12～16 min，18%A；16～23 min，18%→25%A；23～28 min，25%→35%A；28～33 min，35%→60%A；33～35 min，60%→75%A；35～45 min，75%→95%A；45～50 min，95%→2%A。柱温35℃；流速0.3 ml/min；检测波长230 nm；进样量1 μl。

2.2 对照品溶液的制备

取5-羟基马鞭草苷、马鞭草苷、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml 含5-羟基马鞭草苷45 μg、马鞭草苷66 μg、毛蕊花糖苷123 μg 的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过二号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，摇匀，密塞，称定重量，加热回流120 min，冷却，再称定重量，用80%甲醇补重，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜，滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 取药材（A3）粉末约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下检测，重复进样6 次。以毛蕊花糖苷为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，提示仪器精密度良好。

2.4.2 重复性考察 取药材（A3）粉末约1.0 g，精密称定，平行6 份，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下检测。以毛蕊花糖苷为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，提示该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 取药材（A3）粉末约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，室温放置，分别在样品制备后0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下检测。以毛蕊花糖苷为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD＜2%，相对峰面积RSD＜3%，提示供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 超高效液相色谱指纹图谱研究

取11 批马鞭草药材、根、主茎、侧枝、叶和花穗，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下检测，采集不同部位的色谱图，并将其导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）处理，分别以A1、B1、C1、D1、E1 和F1 图谱作为参照，生成药材、根、主茎、侧枝、叶和花穗的指纹图谱共有模式及其对照指纹图谱，见图1。药材及花穗标定共有峰22 个，叶21 个，主茎和侧枝20 个，根14 个。通过对照品比对，指认了7 号峰为5-羟基马鞭草苷、8 号峰为马鞭草苷、12 号峰为毛蕊花糖苷，见图2。计算11 批马鞭草不同部位超高效液相色谱指纹图谱的相似度，结果显示药材与侧枝的相似度较高，均＞0.98；与根的相似度较低，相似度＜0.95的有10 批，提示药材与根整体差异较大。

图1 马鞭草不同部位超高效液相色谱指纹图谱及对照图谱

图2 马鞭草药材共有对照指纹图谱与混合对照品色谱图

2.6 化学模式识别研究

2.6.1 聚类分析 采用HemI 1.0 软件对11 批马鞭草药材及其不同部位超高效液相色谱指纹图谱数据进行热图和聚类分析（空白处记为色谱峰缺失）。热图分析结果显示，花穗、叶、侧枝各共有特征峰颜色偏暖，提示各成分含量较高；根、主茎各共有特征峰颜色偏冷，提示各成分含量较低。聚类分析结果表明药材与侧枝的一致性较高，且与根和主茎区分明显。见图3。

图3 马鞭草不同部位热图和聚类分析树状图

2.6.2 主成分分析 采用SIMCA-P 14.0 软件对11 批马鞭草药材及其不同部位超高效液相色谱指纹图谱数据进行主成分分析，见图4。不同部位样品能够分别集中聚在一起，根和主茎区分界线清晰，但距离较近，提示根和主茎在形态学部位上相连接，化学成分较为接近，仍可以通过主成分分析区分；药材和侧枝聚集在一起，无法区分，提示侧枝与药材无明显差异。

图4 马鞭草不同部位的主成分分析二维得分散点图

2.6.3 偏最小二乘法判别分析 结合VIP 值对11 批马鞭草药材及其不同部位超高效液相色谱指纹图谱数据进行偏最小二乘法判别分析，以VIP＞1.0 作为标准筛选对模型贡献较大的7 个变量，由大到小依次为色谱峰7、17、16、3、21、2、8 号，提示这些成分是引起马鞭草不同部位成分差异的主要标志性成分。

3 讨论

通过指纹图谱进行中药的多组分研究分析更能体现药材质量的整体性[15-21]，基于超高效液相色谱指纹图谱研究药材去除非药用部位的质量评价研究具有十分重要的指导意义[22-25]。本研究结果显示，色谱峰16 号仅出现在花穗中；叶中17 号峰含量非常低，而花穗中含量较高，推测药材中色谱峰16、17 号峰主要来自于花穗，可将其作为6～8 月开花时采收的标志性化学成分，保证化学成分合成和富集。偏最小二乘法判别分析分析显示5-羟基马鞭草苷是形成不同部位差异的重要指标，其在药材中质量分数相对较高，具有抗炎、抗菌等作用，作为评价马鞭草不同部位差异的指标具有重要意义[6,26]。

本研究建立的指纹图谱和化学模式识别分析方法能较好地反映马鞭草不同形态部位化学成分的分布规律及差异性，但不同部位化学成分的差异及所占药材比例不同与临床疗效是否紧密相关，尚需结合药效学及安全性评价进行系统性研究。