C-末端Src 蛋白/黏着斑激酶/上皮钙黏素通路在宫颈癌侵袭转移中的作用及机制研究
2022-08-24唐群华母小琴黄仕兰唐志康廉晓玲
唐群华 母小琴 黄仕兰 唐志康 廉晓玲
湖南医药学院第一附属医院妇科,湖南怀化 418000
宫颈癌严重威胁女性的生命和健康[1],中晚期患者由于淋巴结和远处转移,导致临床疗效不佳[2]。上皮钙黏素(E-cadherin,E-cad)是重要的上皮细胞固有黏附分子,也是上皮性肿瘤侵袭转移的抑制分子[3-4]。C-末端Src 蛋白(C-terminal Src protein,c-Src)/黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)作为互助型复合体具有重要的信号调控功能[5-6]。本研究以宫颈癌组织及细胞系为研究对象,探讨c-Src/FAK/E-cad 通路在宫颈癌侵袭转移中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
选取宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinomas,CSCC)组织标本30 例、正常宫颈(normal cervical,NC)组织标本30例,以上石蜡标本均来源于2019 年1 月至2020 年12 月湖南医药学院第一附属医院(以下简称“我院”)病理科,其中CSCC 中Ⅰ期5 例,Ⅱ期7 例,Ⅲ期10 例,Ⅳ期8 例。另选取我院术中采集的CSCC、NC 组织各1 例。宫颈癌Caski 细胞系来源于我院中心实验室。c-Src 抑制剂(AZD0530)购自碧云天生物技术公司,分子量542 kD。宫颈癌Caski 细胞系分为Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组,Caski 组不进行处理,Caski+c-Src 抑制剂组加入c-Src 抑制剂,使用浓度为2.7 nmol/L[7]。本研究经我院医学伦理委员会审批。
1.2 免疫组织化学染色
采用免疫组织化学染色观察CSCC 与NCT 中E-cad 阳性率。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法,按试剂盒(福州迈新生物技术公司,KIT-9720)说明书操作。步骤如下:CSCC、NC 石蜡标本常规脱蜡切片,加一抗,浓度为c-Src(1∶500),4℃冰箱过夜后加入二抗(1∶500);辣根过氧化物酶法显色,苏木精复染,常规脱水,透明,干燥,封片。结果判断[8]:①按染色深度评分。无染色记为0 分,浅黄色记为1 分,棕黄色记为2 分,深棕色记为3 分。②按阳性细胞比率评分。阳性细胞数占总细胞数<10%记为0 分;10%~<25%记为1 分;25%~<50%记为2 分;≥50%记为3 分。③2 项评分相加。0~1 分为阴性,2 分为弱阳性,3~4 分为阳性,5~6 分为强阳性。阳性率=(弱阳性+阳性+强阳性)/总数×100%。
1.3 E-cad 表达情况与CSCC 临床病理特征关系
收集30 例CSCC 患者的临床病理特征,包括年龄、国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obste-trics,FIGO)分期、分化程度、复发情况、淋巴结转移情况,分析其与E-cad 表达情况的关系。
1.4 Western blot 检测c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平
采用Western blot 观察CSCC、NC 组织中c-Src、FAK、E-cad 蛋白的表达情况。CSCC、NC 组织剪碎研磨,加裂解液;4℃,12000 g 条件下离心30 min,吸取上清液为蛋白样品;水浴变性;SDS-PAGE 电泳;将分离胶中蛋白转到PVDF 膜上;丽春红染色;脱脂奶粉封闭;将PVDF 膜放入杂交袋中,加封闭液和一抗(c-Src、FAK、E-cad 浓度均为1∶1000),冰箱中过夜;加封闭液和二抗,浓度1∶1000;扫描凝胶并照相。Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组无需前处理,直接检测即可。实验重交3 次。
1.5 侵袭及迁移实验
侵袭实验:首先将Matrigel 胶与无血清培养基按1∶100 混合,浸泡小室,在上腔加100 μl 基质胶,紫外线消毒杀菌过夜;上腔加200 μl,下腔加600 μl 无血清培养基;收集细胞,密度为2×105个/ml,上下腔中加入200 μl 细胞,并加入含10%胎牛血清的1640 培养基,48 h 后取出,加无水乙醇固定,结晶紫染色,计数10 个高倍视野中细胞数目。迁移实验不需要Matrigel胶,其余步骤同侵袭实验。
1.6 流式细胞术
采用流式细胞术观察c-Src 抑制剂对Caski 细胞系凋亡的影响。Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组分别用胰蛋白酶消化细胞,制成悬液,保留沉淀加入缓冲液,将细胞吹打均匀,加入Annexin V 及染色剂,混匀,计算机检测细胞凋亡率。实验重交3 次。
1.7 统计学方法
采用SPSS 18.0 对所得数据进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,比较采用t 检验;计数资料采用例数表示,比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 CSCC、NC 组织标本中E-cad 阳性率比较
NC 组织标本的E-cad 阳性率(76.7%,23/30)高于CSCC 组织标本(26.7%,8/30),差异有统计学意义(χ2=15.017,P <0.001)。见图1。
图1 宫颈鳞癌、正常宫颈组织标本中上皮钙黏素阳性率比较(免疫组织化学染色,200×)
2.2 CSCC 患者临床病理特征与E-cad 的表达的关系
E-cad 表达与CSCC 患者的FIGO 分期、分化程度、复发情况相关联(P <0.05)。见表1。
表1 CSCC 患者临床病理特征与E-cad 的表达的关系(例)
2.3 CSCC、NC 组织中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较
CSCC 组织中c-Src、FAK 表达水平高于NC 组织,E-cad 表达水平低于NC 组织,差异有统计学意义(P <0.05)。见图2。
图2 NC 组织、CSCC 中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较(n=3)
2.4 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较
Caski+c-Src 抑制剂组侵袭、迁移细胞计数均低于Caski 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见表2。
表2 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较(个/10 HP,±s,n=3)
表2 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞侵袭、迁移能力比较(个/10 HP,±s,n=3)
2.5 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率的比较
Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率为(14.6±0.8)%,Caski 组细胞凋亡率为(5.1±0.2)%,Caski+c-Src 抑制剂组细胞凋亡率高于Caski 组,差异有统计学意义(t=19.953,P <0.001)。
2.6 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK、E-cad蛋白表达水平比较
Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK 蛋白表达水平低于Caski 组,E-cad 蛋白表达水平高于Caski 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3。
图3 Caski 组、Caski+c-Src 抑制剂组c-Src、FAK、E-cad 蛋白表达水平比较(n=3)
3 讨论
E-cad 缺失能够诱导上皮间质转化发生,导致肿瘤侵袭转移能力增强[9-11]。在宫颈癌浸润及转移灶中大部分E-cad 表达缺失[12]。本研究发现,E-cad 在NC 组织中高于CSCC,且E-cad 表达与肿瘤分化程度、FIGO分期、复发有关,提示E-cad 表达与宫颈癌发生发展有关。
有研究发现,E-cad 表达和功能受c-Src/FAK 的调控[13]。c-Src 在调控细胞生长增殖、黏附等方面发挥重要作用[14-17]。FAK 是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,是整合素信号的中心分子[18];而整合素介导FAK 活化对于细胞播散和迁移至关重要[19]。
c-Src 和FAK 以c-Src/FAK 复合体形式于人体中存在并发挥作用[20]。c-Src/FAK 复合体参与调节细胞凋亡、迁移等病理生理过程[21-22]。在头颈鳞癌、肺癌中,均存在FAK 高表达[23-25]。FAK 增高可促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力[26-27]。FAK 在宫颈癌中高表达,且与宫颈癌恶性程度有关[28]。
本研究结果显示,CSCC 组织中c-Src、FAK 表达增高,E-cad 表达下调,加入c-Src 抑制剂后,宫颈癌细胞侵袭和迁移能力下降,凋亡增多,宫颈癌细胞中c-Src、FAK 下调,E-cad 表达上调。
综上,CSCC 中,c-Src 表达下调可引起FAK 下调和E-cad 表达上调,导致宫颈癌侵袭和迁移能力下降,可能与细胞凋亡增多有关,对于宫颈癌靶向治疗具有重要意义。